Кишечная палочка фото под микроскопом: D0 ba d0 b8 d1 88 d0 b5 d1 87 d0 bd d0 b0 d1 8f d0 bf d0 b0 d0 bb d0 be d1 87 d0 ba d0 b0 картинки, стоковые фото D0 ba d0 b8 d1 88 d0 b5 d1 87 d0 bd d0 b0 d1 8f d0 bf d0 b0 d0 bb d0 be d1 87 d0 ba d0 b0

Содержание

Бактерии под микроскопом. Путешествие в страну микробов

Читайте также

Бактерии в истории человечества

Бактерии в истории человечества Древнеримский историк Квинт Курций Руф в своей «Истории Александра Македонского» так описал одну из его побед при покорении Малой Азии. При осаде города Тироса в 332 году до н. э. в армии Александра Македонского произошло неприятное

Свет убивает бактерии

Свет убивает бактерии Из рассказа о фотосинтезе мы уже знаем, что жизнь зеленых растений зависит от Солнца, дающего им энергию. Но большая часть бактерий иначе реагирует на солнечный свет. Прямые лучи солнца для них губительны.Очень показательный пример вредного влияния

Бактерии, открытые Виноградским

Бактерии, открытые Виноградским Сергей Николаевич Виноградский, выдающийся русский микробиолог, долгое время работавший в Пастеровском институте в Париже, внес огромный вклад в развитие микробиологии.

Центральной темой его исследований было изучение автотрофных

Бактерии, вырабатывающие аминокислоты

Бактерии, вырабатывающие аминокислоты Японские микробиологи в 50-е годы обратили внимание на другую важную роль бактерий. Они выделили микробы, продуцирующие аминокислоты, которые можно было бы использовать для повышения качества пищевых продуктов или как добавку к

1. Бактерии

1. Бактерии После беседы о гигантах растительного мира естественно сказать, хотя бы вкратце, о растениях-пигмеях. Далеко ходить за ними не приходится: они везде и вокруг нас, и на нас, и внутри нас; но видеть их не так-то легко: нужен хороший микроскоп и уменье им

2. Бактерии в почве

2. Бактерии в почве Вы, конечно, знаете, что не всякие бактерии зловредны. Существует много бактерий безвредных, много полезных, а много и таких, без которых едва ли была бы возможна жизнь человека, да и всей органической природы.Вот перед вами колхозное поле пшеницы.

1. Бактерии

1. Бактерии После беседы о гигантах растительного мира естественно сказать, хотя бы вкратце, о растениях-пигмеях. Далеко ходить за ними не приходится: они везде и вокруг нас, и на нас, и внутри нас; но видеть их не так-то легко: нужен хороший микроскоп и уменье им

2. Бактерии в почве

2. Бактерии в почве Вы, конечно, знаете, что не всякие бактерии зловредны. Существует много бактерий безвредных, много полезных, а много и таких, без которых едва ли была бы возможна жизнь человека, да и всей органической природы.Вот перед вами колхозное поле пшеницы. Урожай

Воспоминания можно увидеть под микроскопом…

Воспоминания можно увидеть под микроскопом… При формировании памяти новые отростки и синапсы отращиваются не только аксонами, но и дендритами. Именно непрерывное отращивание дендритами новых маленьких отросточков — дендритных шипиков — играет ключевую роль в

Гены, бактерии, вирусы

Гены, бактерии, вирусы При слове «бактерия» у людей, далеких от биологии, возникают самые неприятные ассоциации. На памяти человечества – жуткие инфекционные напасти вроде опустошительной эпидемии «черной смерти», выкосившей в XIV столетии более 30 % населения Европы. Но

Как бактерии становятся ксенофобами

Как бактерии становятся ксенофобами Способность отличать своих от чужих — фундаментальное свойство живых организмов. На этой способности основаны важнейшие биологические процессы: секс, формирование репродуктивной изоляции, защита от паразитов и конкурентов,

Возвращение бактерии Франкенштейна

Возвращение бактерии Франкенштейна В мае 2006 г. специалисты по синтетической биологии собрались в Беркли (штат Калифорния) на вторую между — народную встречу. Наряду с обычным обсуждением текущих исследований участники выделили время на то, чтобы набросать

Бактерии

Бактерии Микробам — этим бесконечно малым живым существам — принадлежит бесконечно большая роль в природе. Луи Пастер Есть существа, которые не гибнут, если их кипятить 100 часов.Есть существа, которые выдерживают температуру, близкую к абсолютному нулю.Есть существа,

Глава 4. Под микроскопом

Глава 4. Под микроскопом Капельки жизниСамые маленькие из живых организмов называются protozoa, или простейшие. Некоторые из них едва видны невооруженным глазом, но большинство имеют микроскопические размеры. Именно поэтому они изучаются под микроскопом.Представитель

Безопасный секс под микроскопом

Безопасный секс под микроскопом Наряду с большинством животных и растений, у людей половой процесс проходит по типу клеточного слияния — и у нас два пола. Но форма нашего полового процесса очень своеобразна. Самцы не уничтожают свои органеллы — они просто оставляют их

Кто живет у вас под ногтями и почему важно об этом знать

  • Джейсон Голдман
  • BBC Future

Приложение Русской службы BBC News доступно для IOS и Android. Вы можете также подписаться на наш канал в Telegram.

Автор фото, Getty Images

Мытье рук — основной способ защититься от вредных бактерий. Но заботитесь ли вы о чистоте ногтей — точнее, той области ваших кончиков пальцев, что находится под ногтями? Обозреватель BBC Future выясняет, почему это важно.

Все знают, что мытье рук — это лучшее средство борьбы с распространением бактерий. Во многих странах законодательство обязывает сотрудников сферы общественного питания следить за чистотой рук.

С другой стороны, сколько бы мы ни мыли руки, мы не сможем избавиться от всех бактерий.

Именно из-за невозможности достичь полной стерильности врачи и медсестры при взаимодействии с пациентами так часто надевают перчатки.

Еще столетие назад врачи поняли, что даже после неоднократного мытья рук на них остаются бактерии, которые неизменно проявляются в пробах. Однако причина подобной стойкости обнаружилась лишь в начале 1970-х.

Исследователи выяснили, что руки дольше остаются чистыми, если прикрыть кончики пальцев.

Впрочем, бактериями кишат не столько кончики пальцев, сколько наши ногти.

Под этими тонкими кератиновыми пластинками, по составу схожими с рогами носорога и антилопы, можно найти целую коллекцию бактерий.

Автор фото, Getty Images

Подпись к фото,

Исследования показали, что искусственные ногти могут притягивать больше бактерий, чем натуральные

Только в конце 1980-х ученые наконец заглянули под ногти и выяснили, кто там живет.

В исследовании, проведенном тремя научными сотрудниками Пенсильванского университета и увидевшем свет в 1988 году, приняло участие 26 взрослых добровольцев.

Все они работали в медицинской школе университета, но не контактировали с пациентами.

Исследователи пришли к выводу, что именно в подногтевом пространстве прячется больше всего бактерий.

На открытых участках ладоней волонтеров жили сотни тысяч бактерий, в то время как примерно то же число можно было найти всего лишь под одним ногтем — под каждым из ногтей!

Под ногтями скапливались те же бактерии, что и на ладони, просто их было намного больше.

Ученые заключили, что пространство между кожей и ногтем — это идеальная среда для размножения и роста микроорганизмов.

Ноготь защищает их от внешних воздействий, а влажность помогает им расти.

В своей работе исследователи учли предыдущие наблюдения относительно того, что при помощи мытья невозможно достигнуть стерильности рук.

В итоге они заключили, что «существенное количество бактерий в подногтевом пространстве свидетельствует о том, что при обычном мытье рук этот участок относительно недоступен для антимикробных средств».

Только вдумайтесь: самые простые и эффективные средства для борьбы с распространением болезней абсолютно бесполезны, когда речь идет о наших ногтях.

В результате был проведен ряд исследований, посвященных изучению микроорганизмов, живущих под ногтями у сотрудников медучреждений, причем не только под натуральными, но и под искусственными и покрытыми лаком ногтями.

Число этих исследований невелико, но их результаты очень востребованы.

Автор фото, Getty Images

Подпись к фото,

Под каждым ногтем могут жить сотни тысяч бактерий

Всего через год после исследования Пенсильванского университета в свет вышла работа группы медсестер, которых также заинтересовал этот вопрос.

Они обратили внимание на то, что многие медработники поддаются моде и наращивают ногти, несмотря на то, что их безопасность и практичность остаются под вопросом.

Целью исследователей было выяснить, собирается ли больше бактерий под искусственными ногтями (которые обычно длиннее натуральных и покрыты лаком).

Для этого они пригласили 56 медсестер с обычными и 56 медсестер с искусственными ногтями.

Кроме того, они хотели сравнить, насколько эффективным будет мытье рук в обеих группах.

Авторы научной работы обнаружили, что у медсестер с искусственными ногтями на кончиках пальцев было больше бактерий по сравнению с их коллегами с натуральными ногтями — как до мытья, так и после.

Это не обязательно означает, что от них пациентам передавалось большее количество бактерий — просто у них под ногтями проживала более многочисленная колония микроорганизмов.

Тем не менее был сделан вывод о том, что повышенное число бактерий увеличивает риск распространения болезнетворных организмов.

Схожие исследования, опубликованные в 2000 и 2002 годах, дали практически те же результаты.

Однако к тому времени ученые уже выяснили, что искусственные ногти могут препятствовать тщательному мытью рук и усугублять уже имеющиеся проблемы.

К тому же у медработников с искусственными ногтями чаще рвутся перчатки.

С покрытыми лаком натуральными ногтями возникла другая проблема. В этом случае опасность могли представлять небольшие сколы или трещины как вероятные места скопления бактерий.

В 1993 году медсестры из больницы Джона Хопкинса в Балтиморе исследовали ногти 26 взрослых женщин.

Все они работали в больнице, но не взаимодействовали с пациентами. У всех были короткие ногти. Оценка производилась до нанесения лака и через четыре дня после этого.

Автор фото, Getty Images

Подпись к фото,

Просто вымыть руки недостаточно — убедитесь, что ваши ногти тоже чистые

Как оказалось, лак на натуральных ногтях не оказывает такого влияния на населенность подногтевого пространства, как это происходит в случае искусственных.

Исследователи заключили, что важно коротко стричь ногти и держать их в чистоте, а покрыты они лаком или нет — не так важно.

Через год было проведено схожее исследование, и вновь выводы остались неизменными.

Да, через четыре дня на покрытых лаком ногтях скопились бактерии, но свеженакрашенные были в этом смысле в полном порядке.

Ежегодно от диареи умирает от двух до трех миллионов человек. Считается, что мытье рук с мылом могло бы спасти примерно миллион из них.

Вероятно, это правда. Но при одном условии: во время этой процедуры нужно уделять особое внимание ногтям и пространству под ними.

А чтобы наверняка обезопасить себя от инфекции, лучше коротко их подстричь.

И напоследок: прежде чем грызть ногти, вспомните о том, что вы только что прочитали.

Ешь — не хочу: найдены бактерии, способные безопасно помочь похудеть | Статьи

Группа ученых из России и Франции предложила использовать для снижения веса пробиотик на основе бактерий, используемых для создания мягких сыров с плесенью. Эти микроорганизмы вырабатывают активирующий чувство насыщения белок. Эффективность средства уже подтвердили клинические испытания. В планах специалистов — создать фармакологическое средство на основе белка, произведенного бактериями. Вероятно, похудеть удастся, не только употребляя препарат, но и соблюдая диету, предупреждают специалисты. Впрочем, со сниженным благодаря средству аппетитом придерживаться пищевых ограничений должно быть проще.

Бактерии сытости

Ученые из Руанского университета во Франции предложили решить проблему ожирения с помощью кишечных бактерий Hafnia alvei. Они обитают в организме человека и многих животных. Кроме того, во Франции эту бактерию используют для производства мягких сыров, например, камамбера. Поэтому ее безопасность при введении «извне» доказана, однако как пробиотик на основе Hafnia alvei еще никто не использовал.

Эти бактерии вырабатывают белок ClpB (пищеварительный фермент Caseinolytic peptidase B), который дает чувство насыщения и сжигает запасы жировой ткани. Когда клетки, активированные ферментом, начинают работать, чувство голода проходит.

Этот белок выделяют и некоторые другие бактерии, например кишечная палочка. Но не все они безопасны для человека.

— Бактерии Hafnia alvei и гены, ответственные за синтез белка ClpB, присутствуют в кишечнике у здоровых людей, — рассказал автор исследования, профессор Руанского университета, руководитель направления «Микробиота — мозг и регуляция пищевого поведения» в Институте физиологии имени И.П. Павлова Сергей Фетисов. — Однако у людей с ожирением их количество снижено, показал анализ образцов микробиоты нескольких сотен людей. Идея профилактики и лечения ожирения заключается в том, чтобы давать бактерии как пробиотик тем людям, которые обладают избыточной массой тела и желают от нее избавиться путем воздействия на чувство насыщения.

Фото: ИЗВЕСТИЯ/Павел Бедняков

В кишечнике идет постоянный цикл деления, размножения и гибели бактерий. Около 1% от состава микробиоты кишечника вырабатывают белок ClpB. Он естественным путем синтезируется во время деления бактерий при получении питательных веществ. Таким образом, сразу после приема пищи ClpB действует на рецепторы клеток стенки кишечника, стимулируя секрецию гормонов насыщения.

Эти гормоны поступают в кровь и действуют на рецепторы в нервных окончаниях и в мозге. Кроме того, сам белок также может всасываться в кровь и может перенестись в любое место организма, включая головной мозг. Там белок активирует те же нервные клетки, что и гормон насыщения лептин, вырабатываемый в жировой ткани.

У полных людей них вырабатывается слишком много лептина. Рецепторы клеток в мозге перестают реагировать на него, и чувство насыщения не наступает. Это приводит к перееданию.

Двойной удар

По гипотезе ученых, метод двойного воздействия белка ClpB на рецепторы мозга позволяет обойти тот факт, что у людей с избыточной массой тела чувство насыщения приходит с задержкой.

Фото: Depositphotos

В совместном проекте с Институтом физиологии имени И.П. Павлова (направление будет развиваться в рамках проекта центра «Интегративная физиология — медицине, высокотехнологичному здравоохранению и технологиям стрессоустойчивости») французские ученые планируют исследовать возможность создать фармакологическое средство от ожирения на основе белка ClpB.

Ученые уже провели доклинические испытания на мышах с избыточной массой тела. Среди животных были индивиды как генетическим ожирением, так и со спровоцированным усиленным питанием. Подопытным давали «дозу» бактерий раз в день, и в итоге мыши сбросили вес, хотя и не избавились от лишнего веса полностью. Снижение массы началось уже после четырех дней добавления бактерий в рацион мышей и продолжалось в течение всего эксперимента. В итоге они стали меньше есть и набрали наполовину меньше веса, чем мыши без пробиотика. При этом снижение количества съедаемой пищи и потеря веса не наблюдались у животных, получивших те же бактерии, но не способных синтезировать белок ClpB.

Кроме того, клинические испытания бактерий были недавно проведены в Германии, — рассказал Сергей Фетисов. — Они тоже показали положительный результат — после трех месяцев приема в капсулах, защищающих бактерии от желудочного сока, у мужчин и женщин с повышенной массой тела. Они придерживались легкой диеты, и в группе людей, принимавших бактерии, отмечалось достоверное снижение чувства голода.

Это позволило испытуемым значительнее снизить вес и уменьшить размер талии, чем группе, получившей плацебо, добавил Сергей Фетисов.

Фото: Depositphotos

— Применение пробиотика на основе данных бактерий я бы поставила под сомнение, — сказала «Известиям» врач-диетолог, иммунолог-аллерголог Марина Аплетаева. — В желудке крайне агрессивная среда, призванная уничтожать входящие туда живые организмы. Иначе бы человек, сотни тысяч лет питавшийся «с земли» и сырым мясом, просто бы не выжил. Есть затруднения и при прохождении бактерий через двенадцатиперстную кишку, особенно у полных людей. А вот применение лекарства на основе белка внушает уже гораздо больший оптимизм. У него гораздо больше шансов помочь, чем у чистого пробиотика.

Вечно худеющие

Употребление и пробиотика, и белка будет иметь временный эффект, считает заведующий кафедрой технологии переработки зерна, хлебопекарного, макаронного и кондитерского производств Московского государственного университета технологий и управления имени К.Г. Разумовского Игорь Никитин.

— Состав микрофлоры организма человека имеет динамическое равновесие, обусловленное рядом факторов: местность проживания, генетика, особенности питания и так далее, — пояснил эксперт. — Поэтому раз и навсегда заселить кишечник нужным количеством бактерий для постоянного поддержания чувства сытости не представляется возможным. Лекарство на основе белка придется принимать тоже постоянно. Однако видимых противоречий в описанном эффекте воздействия ClpB и бактерий Hafnia alvei на организм я не вижу. Вполне возможно, это станет одной из методик для снижения веса.

Основа снижения массы тела — снижение калорийности рациона и его сбалансированность, напомнила старший научный сотрудник отделения профилактической и реабилитационной диетологии ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Юлия Чехонина.

Фото: ИЗВЕСТИЯ/Зураб Джавахадзе

— Тогда меняется пищевое поведение, человек избавляется от привычек, которые привели к набору веса и привыкает к новому, правильному пищевому поведению, — сказала она. — Также важное значение имеет достаточное потребление белка, в том числе и как материала для синтеза регуляторных гормонов, отвечающих на насыщение. Бактерии не способны создать эффект формирования новых пищевых привычек. Более того, есть шанс, что без искусственного поддержания чувства сытости человек вернется к прежнему питанию и весу.

Активация нейронов, связанных с подавлением аппетита, может отличаться у разных людей, добавил Игорь Никитин. В том числе это зависит от количества таких точек в мозге и их восприимчивости. Эти факторы генетически обусловлены. Их стоит попробовать учесть при проведении испытаний и создании фармакологического средства на основе белка ClpB, считает эксперт.

Планета бактерий

 Константин Северинов: чему мы можем научиться у господствующей на Земле формы жизни


 

Окруженные со всех сторон бактериями, мы сидим в кафе Сколтеха, подкармливаем кофе с пирожными бактерий, проживающих в нашем теле, и говорим о бактериях, с каждым сказанным словом вдыхая и выдыхая их. Константин Северинов — один из тех ученых, кто, добившись международной известности, вернулся делать науку в Россию. Выпускник биофака МГУ, сейчас он заведует лабораториями в Институте биологии гена РАН и в Институте молекулярной генетики РАН, является профессором Сколковского института науки и технологий и профессором Университета Ратгерса (США). Впрочем, для нас главное — что он изучает этих маленьких невидимых существ, которые первыми заселили Землю​.

— Мне интересно, чтоб было интересно, — пожимает плечами Северинов. — Интересы, конечно, меняются, но я решил заняться биологией лет в шесть-семь и с тех пор не жалею. Я точно знаю, что мне неинтересно: делать полезные вещи ради пользы.

Кстати, я абсолютно убежден, что самые полезные приложения в биомедицине возникают не потому, что вы, например, решили победить рак и будете с ним бороться. Наука не боксерский матч. Отгадка, как правило, находится вовсе не там, где ее ищут.

Сейчас мне интересней всего, как происходит экспрессия генов, — как на молекулярном уровне принимается решение, чтобы ген начал или остановил свою работу. Эти процессы универсальны, понять их очень важно — они лежат в основе развития организма или заболеваний, таких как рак. А еще мне интересна экология микробов, взаимодействие микробов и вирусов друг с другом и с высшими организмами. Ведь основная форма жизни на Земле — это микробы. Она не только самая древняя, но и самая разнообразная, хоть мы и считаем себя венцом творения, самыми важными обитателями Земли. В реальности это, конечно, не так.

 

Главные жители Земли

[Кот Шрёдингера] Да ведь это мы — многоклеточные, такие разнообразные и непохожие друг на друга! А микробы хоть и существуют на миллиарды лет дольше, не слишком отличаются друг от друга, по крайней мере для неспециалиста.

[КС] Всё ровно наоборот: это мы очень скучные и одинаковы, а они очень даже разные! Критерий разнообразия — не ручки-ножки или цвет глаз, а разнообразие генетическое. Ведь всё живое — это просто генетический текст, послание, закодированное в виде последовательностей нуклеотидов ДНК. Оценить разнообразие жизни можно просто сравнив эти тексты. Точно так же можно оценить, например, разнообразие группы восточнославянских языков, сравнив русский, украинский и белорусский и подсчитав, сколько различий они накопили.

Бактерии — микроорганизмы, клетки которых не содержат ядра (прокариоты). Еще прокариотами являются археи, но их куда меньше. На сегодня описано около 10 тысяч видов бактерий, но предполагается, что их свыше миллиона. Впрочем, понятие «вид» у бактерий довольно условное.

Биоинформатика — очень модная наука. Она изучает, как передается и обрабатывается информация в живых клетках и между ними. В узком смысле — математические методы анализа геномов, позволяющие сравнивать их.

Геном — записанная с помощью ДНК наследственная информация, копия которой содержится в каждой клетке организма. Работу генома как организованного целого изучает геномика.

Представьте себе универсальное древо жизни — огромное дерево, на котором каждая веточка — это некий генетический текст, соответствующий какому-либо организму. Это дерево очень большое, и происходим мы из одного корня: вся жизнь возникла на планете единожды. Точнее, вся современная жизнь. Так вот, на этом очень разлапистом, ветвистом дереве все человечки, животные, растения и рептилии — это лишь одна небольшая веточка, а все остальные очень разные ветви — как раз микробы. Они для нас однообразны, потому что мы их не видим. Но с молекулярной точки зрения они составляют 90–95% разнообразия жизни на планете.

[КШ] Как это генетическое разнообразие проявляется в жизни микробов?

[КС] Я недавно готовил конференцию под названием «Экстремофилы», и мы общались с шефом департамента науки в Минобре. Так он сначала думал, что экстремофилы — это люди, которые катаются на горных лыжах вне подготовленных трасс. Экстремофилы — это и правда любители экстремальных условий, но только микробы. Условия жизни на планете очень разнообразны: от вечной мерзлоты до горячих источников, в которых может быть 110–120 градусов, а те из них, что на дне океана, находятся еще и под гигантским давлением. Есть места с безумной концентрацией соли, как Мёртвое море. Или с огромным количеством кислоты. И везде кипит жизнь, но единственные, кто там живет, — те самые микробы-экстремофилы. Происходит это потому, что они обладают удивительной генетической изменчивостью и адаптивностью. И в земле они есть, и в стратосфере. Вся планета, в духе учения Вернадского, живая.

[КШ] Вот тут, вокруг нас, воздух весь ими заполнен?

[КС] Что значит «заполнен»? Вон микроб пролетел, видите? Да, их много: в кубическом метре воздуха микробов примерно столько, сколько людей в Москве. А в кубическом сантиметре снега в Антарктиде от 10 до100 бактериальных клеток. Они могут не жить активно, а просто сидеть, словно пассажиры, и ждать, когда какой-нибудь айсберг отвалится и увезет их в Африку.

Фото: Фотобанк Лори  /  Колонии бактерий в чашке Петри.

Этот лабораторный сосуд был изобретён в 1877 году и назван так в честь изобретателя,

немецкого бактериолога Юлиуса Петри, ассистента Роберта Коха

  

Как эволюционируют микробы

[КШ] Бактерии эволюционируют быстрее других существ?

[КС] Просто они быстро делятся, и их очень много. Они словно самим господом богом созданы для эффективного естественного отбора. Кишечная палочка делится за 15 минут. Если вы посадили одну бактерию кишечной палочки в чашку, то через 8 часов обнаружите колонию ее потомков размером с булавочную головку — в ней будет 10 миллионов бактерий, это опять-таки — столько, сколько человек живет в Москве.

Чтобы попытаться выработать у москвичей устойчивость к радиации, придется взорвать над столицей атомную бомбу и ждать потомства от выживших. С бактериями всё гораздо проще — вырастили колонию за 8 часов, облучили ее, и вот уже можно изучать потомство наиболее жизнестойких особей. С ними удобно работать! Быстрее ли они эволюционируют? Нет, просто быстрее размножаются.

Горизонтальный перенос генов— передача генетического материала другому организму, не являющемуся потомком. 

Митохондрия — органелла (орган клетки) размером с бактерию, запасающая и высвобождающая по мере надобности энергию. У нее есть свой геном. Считается, что митохондрии — это бывшие бактерии, которые внедрились в клетки более продвинутых организмов.

Ретровирусы — вирусы, генетическая информация которых содержится в на молекуле РНК. После проникновения ретровируса в клетку его РНК переписывается в ДНК, которая транспортируется в ядро и встраивается в ДНК клетки. Самый известный представитель — ВИЧ.

[КШ] У них, кажется, есть специальный механизм, позволяющий обмениваться генами разным видам бактерий?

[КС] Есть, действительно. Генетика дарвинизма предполагала только вертикальную передачу признаков — по наследству. Всё древо жизни казалось такой ветвящейся структурой, растущей из одного корня и постепенно усложняющейся. Наверху, конечно же, всегда был человек. Предполагалось, что у каждого вида своя эволюционная траектория, идущая от общего корня, и эти траектории не пересекаются.

Но у бактерий широко распространен горизонтальный перенос генов, когда один вид обменивается генами с другим. Вот представьте себе: пошли вы в зоопарк, увидели слона — вам понравился его хобот, вы обменялись со слоном соответствующими генами и ушли уже с хоботом. Бактерии так делают часто — для одноклеточных это просто. И получается, что ветви на эволюционном древе не изолированы, а образуют сеть.

[КШ] Обмен генами случаен или бактериям действительно может понравиться чужой «хобот»?

[КС] Случаен, никто ничего не выбирает. Допустим, сидят себе бактерии, и тут вдруг становится очень плохо — среда изменилась. Большинство бактерий умирает, и вся их ДНК вытекает наружу. А некоторые выживают и встраивают в себя части этой ДНК. Большинству это ничего не дает, а кто-то получает новые возможности — он растет, и ему становится совсем хорошо, потому что все вокруг погибли: еды куча, никто не мешает.

Фото: Microbe World/flickr.com  /  Споры сибирской язвы.

Они могут выдержать долгое кипячение и подолгу не гибнут в дезинфицирующих препаратах

 

[КШ] У людей довольно большая часть ДНК вирусного происхождения. Значит, тут тоже речь идет о горизонтальном переносе. Возможен ли перенос генов от бактерий к людям?

[КС] Нет, у нас с бактериями разные вирусы. У нас нет бактериальных генов, кроме тех, что мы когда-то получили от бактерий, ставших митохондриями в клетках нашего организма. Помните, как возникли клетки, от которых произошли мы и все, кого мы видим в зоопарке? Наш одноклеточный предок захватил некую древнюю бактерию и заставил ее кашу варить — энергию вырабатывать. Но чтобы эта бактерия не прибила нашего предка, большинство генов из нее было перенесено в ядро.

А гены вирусов, про которые вы говорите, действительно составляют у нас солидную часть генома. Это остатки ретровирусов, которые встроились в разные места нашей ДНК. Они встроились так, чтобы мешать работе наших генов, но испортились потихонечку. Некоторые из них, правда, еще могут прыгать по ДНК, и когда они прыгают, то могут возникать неприятные вещи типа рака. Кстати, интересно, что мы довольно сильно отличаемся от обезьян по «вирусному геному», а те 30 тысяч генов, которые кодируют белки, отличаются от обезьяньих гораздо меньше.

  

Это год, когда человек впервые увидел бактерии. Это был голландский натуралист Антони ван Левенгук, усовершенствовавший микроскоп. Как и всех прочих микроскопических существ, он назвал их «анималькули». 

[КШ] Способны ли бактерии наследовать приобретенные признаки?

[КС] Несколько назад опыты показали, что таки да, у бактерий может быть так называемая ламарковская наследственность, связанная с горизонтальным переносом генов. Например, у бактерий открыли некую новую иммунную систему. У людей, которые занимаются оптимизацией штаммов для молочной промышленности, есть большая проблема: вирусы убивают ферментацию, и миллиарды долларов теряются из-за испорченного молока. Если вирус заражает бактерию, все бактерии дохнут, но иногда возникают бактерии, устойчивые к вирусу. Почему?

Оказалось, вовсе не потому, что в популяции изначально были резистентные  бактерии. Механизм возникновения устойчивости обнаружился такой: небольшой кусочек ДНК вируса попадает в геном бактерии и делает ее устойчивой к вирусу. Этот захваченный фрагмент ДНК, примеряется к заходящему вирусу, и если обнаруживается полное соответствие, бактерия вирус убивает. Это как память, которая передается по наследству. Но такая иммунная система не очень эффективна: она работает только при условии, что чужеродная ДНК точно соответствует захваченному куску. Даже одно различие не позволит убить вирус.

Но с точки зрения генных инженеров и ученых, которые хотят лечить всякие генные болезни, этому механизму цены нет — на его основе совсем недавно был создан метод редактирования генома CRISPR, который сейчас не использует только ленивый. Я думаю, первое действительно эффективное лекарство от рака возникнет именно благодаря этой технологии. Есть, например, больной с лейкемией, у него в ДНК изменена лишь одна буква из трех миллиардов. До недавних пор не было технологии, позволяющей найти и изменить единственную опечатку. А эта система способна гарантированно узнать неправильную копию и уничтожить ее. То есть бактериальную иммунную систему фактически научились инсталлировать в человеческую клетку, и она работает как часы. Теперь мы можем заменить любую букву в нашем генетическом коде.

Фото: Microbe World/flickr.com  /  Колония сальмонеллы.

Этот род бактерий назван в честь их открывателя ветеринара Дэниеля Салмона (1850–1914)

 

[КШ] Скоро ли методы редактирования генома позволят нам самим создавать полезных микробов?

[КС] Молекулярная инженерия существует давно — с 1973 года, и изменить бактерию не такая сложная задача. У моих студентов в Сколтехе завтра начинается практикум: они все будут это делать. Но что получится, мы не знаем. Предсказать, как изменение гена или внесение дополнительного гена повлияет на конечный результат, мы пока не можем.

Сейчас в моду входит системная биология, которая пытается предсказать последствия генетических изменений в организме, пытается конструировать какие-то новые генетические сети с требуемыми свойствами. Чтобы кишечная палочка, например, ела нефть, ей нужно ввести некий комплекс генов, который, по мнению исследователей, связан со способностью перерабатывать нефть. Эта задачу очень трудно решить — мы слишком мало знаем. Изменить ген легко, но, скорее всего, то, что получится, не будет работать: вы просто испортите генетический механизм, и палочка умрет либо станет кривая или косая.

  

Зоопарк внутри человека

[КШ] Если они так хорошо приспосабливаются, не обречены ли мы на проигрыш в гонке вооружений с микробами? Рано или поздно появится смертельная инфекция, с которой невозможно будет справиться…

[КС] Эти страхи возникли еще в XIX веке с подачи Пастера, когда вдруг выяснилось, что мы находимся в состоянии войны с коварным противником — микробами. Но реальная ситуация совершенно не такая. Большинство микробов о нас знать не знают, они занимаются своими делами, и мы им глубоко безразличны. Идея, что микробы — это что-то очень плохое, посланное богом за наши прегрешения, совершенно неверна. Мы зависим от микробов гораздо больше, чем они от нас. Наше тело состоит из триллиона клеток — потомков единственной оплодотворенной яйцеклетки. При этом внутри нашего организма находится 10 триллионов бактериальных клеток! Большая часть из них живет в кишечнике и составляет огромный орган, который сейчас называют микробиом.

Обычно говорят, что самый крупный орган человека — печень: она весит больше мозга. Но на самом деле это, конечно, микробиом. Он выполняет массу совершенно необходимых для нас функций. Например, наши клетки вдруг потеряли возможность производить ряд витаминов, необходимых для жизни. Мы можем себе это позволить, потому что в нас живут бактерии, которые производят эти витамины. Они вносят огромный вклад и в работу иммунной системы, защищая нас от вредных бактерий, которых абсолютное меньшинство.

Метагеном — совокупный геном сообщества организмов, живущих вместе. Недавно, например, китайские ученые прочитали метагеном микробов, обнаруженных в смоге Пекина. Их там оказалось очень много, больше тысячи.

Микробиом человека — сообщество бактерий, живущих в нашем кишечнике. Мы никогда не будем одиноки!

Секвенирование — определение последовательности нуклеотидов, из которых состоит ДНК, то есть прочтение генетического кода.

[КШ] Бактерии, которые внутри нас живут, хорошо изучены?

[КС] Ученые совсем недавно поняли всю степень их разнообразия, что у нас внутри целый зоопарк, огромная «темная материя» микробов. Раньше микробиологи изучали только те бактерии, которые им удавалось вырастить в чашке Петри. Но подавляющее их большинство — 99,99% — просто не хотят на наших чашках расти, им не нравится питательная среда, которую мы им предлагаем. А современные методы геномного секвенирования позволяют читать геномы даже бактерий, культивировать которые не получается.

Вот вы можете походить по комнате с пылесосом и засосать воздух, а потом с помощью современных машинок выделить из пыли все ДНК и определить так называемый метагеном комнаты. Метагеном — это набор генов всех организмов, которые присутствовали в анализируемом образце. И в нем вы обнаружите огромное количество генетических следов разнообразных неизвестных бактерий. Если речь идет о метагеноме кишечника, то вы можете найти корреляции между какими-то кусками этих генетических текстов и какими-то свойствами человека — например, продолжительностью его жизни или какими-то патологиями.

  

[КШ] Метагеном каждого человека уникален?

[КС] Человек несет в себе уникальный набор микробов, внутри семьи они обычно похожи. Это важно для диагностики и персональной медицины ближайшего будущего, например для разработки правильной диеты. Диета оказывает огромное влияние на что угодно. Но когда я ем шоколадку, мои клетки получают не какао, сахар и масло, а продукты их глубокого разложения живущими в моем пищеварительном тракте бактериями. Есть такая замечательная вещь, как пересаживание кала, — этот метод в США прошел клиническое испытание на людях и уже используется. Оказывается, лучший способ похудеть — это пересадить себе какашку худого человека, которая, как известно, в основном состоит из его бактерий.

В дальнейшем можно будет на своей странице в соцсетях выставлять не только геном, но и метагеном. И если какой-нибудь Цукерберг или Брин будут иметь доступ к этой информации, они смогут проводить исследования, например, о связи определенной бактерии с желанием, я не знаю, купить айфон. А медики, скажем, выяснят, что все, кто ел огурцы и имел такую-то бактерию, рано умерли. То есть бактерии могут служить диагностическими маркерами заболеваний или какого-то поведения.

 

Таков размер самой крупной бактерии Thiomargarita namibiensis.  Большинство же бактерий имеют размер 0,5–5 мкм. 

[КШ] Сейчас что можно сказать о человеке, проанализировав его метагеном?

[КС] Да почти ничего. Кстати, проанализировав геном, тоже почти ничего пока нельзя сказать. К сожалению, это сложно. Любой человек с точки зрения геномики — это, в общем, одна и та же книжка. Если вы возьмете «Войну и мир» и увеличите ее в тысячу раз, там будет три миллиарда букв. Каждый из нас — произведение, содержащее три миллиарда букв ДНК, но при этом отличаемся друг от друга лишь на 0,1% этой последовательности — на три миллиона букв. Эти «опечатки» обеспечивают нашу индивидуальность и предрасположенность к болезням. Есть очень простые заболевания, как гемофилия у Романовых, причиной которой служит одна-единственная опечатка. Но на возникновение шизофрении или рака влияют десятки и сотни опечаток — пока вычленить все влияния не представляется возможным. С микробиомом то же самое.

[КШ] А как же антибиотики? Получается, они разрушают всё наше уникальное сообщество бактерий?

[КС] Такое ощущение, что, хотя на короткое время антибиотики резко всё меняют, потом микробиом восстанавливается в прежнем виде. Возможно, это связано с аппендиксом. Некоторые ученые утверждают, что аппендикс — это такой резервуар, маленький домик для нашей микрофлоры.

Фото: Shutterstock  /  Heliobacter pylori. Считается, что именно эта бактерия виновна в развитии язвы желудка

 

О чем микробы говорят друг с другом

[КШ] Почему разные страшные эпидемии обычно приходят из Африки? 

[КС] Думаю, это не совсем правильное утверждение, — уверен, например, что туберкулез не оттуда. В Африке просто разнообразные условия и биоразнообразие очень большое. Это такая гигантская лаборатория, в которой можно обкатывать всякие новые варианты. И одна из причин, почему Африку так тяжело было завоевать или покорить. Европейская цивилизация развивалась в схожих климатических условиях. А когда вы движетесь с севера на юг, возникают новые климатические зоны с новыми микробами. То же самое в вытянутой с севера на юг Америке: майя, инки, ацтеки почти не общались друг с другом, потому что не могли пройти этот барьер — в новых природных условиях их убивали непривычные для их организма микробы.

[КШ] Сами бактерии как-то общаются между собой?

[КС] Безусловно, с помощью химических сигналов. Антибиотики ведь не люди изобрели — это вещества, с помощью которых микробы общаются друг с другом. Ученые всегда изучали бактерий в чистой культуре определенного вида, но в природе такого не бывает: у любого места обитания свой микробиом, сообщество разных микробов, где все зависят друг от друга. У них сложные отношения, всё как у людей, хотя конечная цель каждого вида — победить, всё захватить. Но другие бактерии не дают — возникает какой-то баланс.

Самая важная информация для бактерий — это есть ли еда, сколько вокруг других представителей твоего вида и других видов. Определяют они это с помощью механизма, который по-английски называется quorum sensing, — некоторые переводят это как «чувство локтя». В небольшом объеме среды каждая бактерия выпускает наружу какое-то вещество, которое ее собратья могут почувствовать. Если бактерий много, то и вещества будет много — они поймут, что здесь тесно и, вместо того чтобы размножаться как бешеные, образуют споры или биопленку. Так, например, происходит в легких больного муковисцидозом — микробы говорят другу: «Нам здесь стало очень тесно» и образуют пленки, а больной при этом умирает. Для таких сообщений им и нужны антибиотики.

Фото: Andrii Muzyka/Shutterstock  /  Бактерии и вирусы в сосуде человека среди клеток крови

 

[КШ] То есть антибиотик — это сигнал типа «убей себя», а не какой-то яд, который, допустим, мембраны разрушает?

[КС] Да, антибиотик — это информация, сигнальная молекула, которая изменяет экспрессию генов. В природе антибиотики, как правило, не достигают такой концентрации, при которой убивают. А поскольку антибиотики были изобретены бактериями для общения между собой, то и гены устойчивости к антибиотикам возникли давным-давно, задолго до всяких врачей. Именно поэтому победить устойчивость к антибиотикам всё равно никогда не удастся. Гены устойчивости появились не потому, что злые бактерии вдруг решили наступить на горло нашей песне. Если вы возьмете образцы бактериальной ДНК из скважины, пробуренной в вечной мерзлоте, то, конечно, найдете гены устойчивости ко всем антибиотикам. Ведь бактерия, которая их производит, по определению к ним устойчива, то есть сама является источником антигенов.

 

Война с микробами: антибиотики и бактериофаги

[КШ] Что-то в последние десятилетия ничего не слышно о новых антибиотиках.

[КС] Они не появляются с конца 80-х годов. Во-первых, до недавнего времени антибиотики, которые были, и так работали хорошо. Во-вторых, новые найти очень непросто. Золотой век антибиотиков закончился. Вот я, например, работаю в Институте микробиологии Ваксмана [подразделение Университета Ратгерса — КШ] , а Ваксман — это человек, который получил Нобелевскую премию за стрептомицин, которым изначально лечили туберкулез. Так вот, он отправлял своих друзей и сотрудников по городам и весям за образцами земли, потому что большинство антибиотиков производится почвенными бактериями: их там слишком много живет — вынуждены общаться. В институте, построенном на его Нобелевскую премию, эти почвенные бактерии до сих пор болтаются — работать там невозможно, потому что они всё перезаразили. Крупные фармкомпании тоже собирали образцы почвы по миру и потом из найденных в ней бактерий выделяли антибиотики. Выделяли-выделяли — так возникло большинство антибиотиков, но постепенно новые перестали появляться. Потому что количество культивируемых бактерий невелико.

Для того чтобы выделять новые антибиотики, по-видимому, будет использоваться та самая геномика, которая позволяет смотреть генетическую информацию «темной материи» неизвестных бактерий. Биоинформатика может выделить кластеры генов, которые потенциально могут кодировать антибиотики, потом генные инженеры будут создавать специальные штаммы-продуценты.

Собственно, этим и я занимаюсь — мы делаем предсказания: мол, такая-то бактерия, такие-то гены могут быть ответственны за производство таких-то веществ. Потом мы это вещество должны получить, поймать, охарактеризовать, выявить его структуру, показать, что это вещество действует на клетку, понять, как именно действует, почему оно проходит в клетку, почему убивает клетки и при этом не убивает ту клетку, которая его производит, как вещество делается.

Фото: NOBEASTSOFIERCE/Shutterstock  /  Раскрашенная электронная миктофотография бактерии сальмонеллы, возбудителя самльнонеллеза

 

[КШ] То есть у вас в лаборатории есть претенденты на новые антибиотики?

[КС] У нас есть некоторое количество новых, еще не описанных веществ с интересными функциями. Но мы изучаем их с точки зрения механизмов действия, а не с точки зрения практического применения.

Понимаете, найти какое-то вещество, которое убивает бактерию, несложно, таких веществ десятки тысяч. Проблема в том, что антибиотик не должен вызывать в клетках человека никаких разрушений. Еще вы должны будете доказать, что, если он попадет в кровь, то будет поглощаться и доставляться к источнику инфекции в требуемой концентрации. Он должен быть достаточно стабилен, его нужно произвести в больших количествах, и это должно быть экономически выгодно. С точки зрения промышленного производства всё это гораздо важнее, чем просто найти антибиотик.

Столько разновидностей бактерий живёт у вас во рту (приблизительная оценка). При среднем поцелуе партнеры обмениваются примерно 80 миллионами бактерий. 

[КШ] Так все-таки, не уничтожат нас микробы, пока мы будем решать все эти вопросы? Появляются новые болезни, бактерии быстро приобретают устойчивость к антибиотикам… 

[КС] Это, конечно, ужас, но не ужас-ужас-ужас. Прямо сейчас никто не вымирает. Новых болезней немного, а вот масса заболеваний, которые до недавних пор воспринимались как генетические или связанные с какими-либо дефектами, как выясняется, имеют бактериальную природу: от диабета до колитов и даже шизофрении — оказывается, чтобы завелись тараканы в голове, нужны кое-какие бактерии в животе.

[КШ] Сможем ли мы когда-нибудь победить все инфекции, найти средство от всех вредных микробов?

[КС] Нет, излечить всё и вся, конечно же, не получится. Взять те же антибиотики: если они очищают от микробов какую-то нишу, где те спокойно жили, там обязательно заводится кто-нибудь другой. Все-таки жизнь существует уже 3,5 миллиарда лет и научилась приспосабливаться ко всяким разностям. Особенно учитывая, что бактерии постоянно обмениваются своими генами и вирусами. А мы — та среда, в которой происходит их отбор. Когда среда меняется, меняются и они.

Фото: Shutterstock  /  Бактерия путешествует по кровяному руслу

 

[КШ] Кроме антибиотиков у нас есть еще одно супероружие — бактериофаги.

[КС] Бактериофаги — это вирусы бактерий, их огромное количество. Бактериям в этом смысле жить гораздо тяжелее, чем нам. Поскольку каждый бактериофаг специфичен к той бактерии, на которой паразитирует, они могут быть эффективнее, чем антибиотики. Бактериофаги открыли лет сто назад, и изначально именно их планировали использовать против бактерий. Но открытие антибиотиков позволило на время забыть про бактериофагов.

Тем не менее в бывших соцстранах бактериофаги широко применялись, потому что, с одной стороны, с антибиотиками у нас были проблемы, а с другой — человек, открывший бактериофаги, Феликс Д’Эрелль, большой любитель путешествий и экзотических женщин, приехал в середине тридцатых готов в Грузию, нашел там всё, что любил, и создал институт бактериофагов. Потом, правда, удрал, говорят, не поделил женщину с каким-то энкавэдэшником. Но институт остался, там же был завод, где делались таблетки, такие заводы и сейчас есть в Нижнем Новгороде и Перми. У советского солдата в личном пакетике всегда была таблетка интестифага. Кстати, большинство войн сегодня  проигрывается, как и во времена Римской империи, не из-за поражений, а из-за поносов.

[КШ] Чем бактериофаги хуже антибиотиков? 

[КС] По идее, бактериофаг очень удобен, потому что убивает именно ту бактерию, под которую заточен. Но он сам по себе вызывает иммунный ответ организма. Еще одна проблема — конструирование новых бактерий: бактериофаги часто переносят ДНК от одной бактерии к другой. И масса новых патогенов — это обычные бактерии, которые просто подцепили вирус. Поэтому есть сильное подозрение, что широкое использование бактериофагов могло бы привести к развитию новых опасных патогенов.

Точных ответов никто не знает, слишком мало было надежных исследований. На Западе интерес к этой теме сейчас возрос: например, бактериофагами лечат «ножки Буша», на которых развивается сальмонелла, — опрыскивают их, как спреем, и увеличивают срок годности.

У бактериофагов есть гены, которые позволяют убить клетку. И если вы умеете читать геномы бактериофагов и определять нужные гены, то можете просто применять их как инструмент для выделения генов, продукты которых могут быть использоваться как кандидаты в антибиотики.

Опубликовано в журнале «Кот Шрёдингера» №4 (06) за апрель 2015 г.

  

Источник: kot.sh

Кишечная палочка — Escherichia coli. О пользе и вреде.

Кишечная палочка — Escherichia coli. О пользе и вреде

Расстройство желудка, диарея, общая слабость, тошнота, боль в животе – подобные симптомы мы чаще всего связываем с кишечной палочкой.  Наличие этого представителя микрофлоры в организме многих пугает. Но, на самом деле, кишечная палочка (или как правильно ее называют Escherichia coli) присутствует у любого человека.

О пользе и вреде кишечной палочки рассказывает сотрудник лаборатории Explana, бактериолог Марина Ивановна Полещикова

— Для чего в организме здорового человека нужна кишечная палочка?

Кишечная палочка является нормальным обитателем кишечника человека и теплокровных животных и важной частью кишечной микрофлоры, поддерживающих нормальное физиологическое состояние у здоровых людей.   Уже в первые дни после рождения в кишечнике человека появляется Escherichia coli и сохраняется на протяжении всей жизни. У человека бактерии составляют, в среднем 1% микробной массы испражнений, но именно этот процент играет важнейшую роль в функционировании желудочно-кишечного тракта. Прежде всего, кишечная палочка помогает вырабатывать витамины, такие как В1, В2, В3, В5, В6, В9, В12 и К, также активно участвует в обмене жирных и желчных кислот, холестерине, билирубине и т.д.. Существует целый ряд пробиотических препаратов, в состав которых входит и кишечная палочка.

— Какой же должная быть норма кишечной палочки в организме?

Норма кишечной палочки в 1г фекалий у здорового человека 107 – 108 КОЕ/г.

— А если в организме недостаток кишечной палочки, к каким последствиям это может привести?

Если в организме человека кишечная палочка присутствует меньше своей нормы, то это может привести к дисбиозу, который проявляется в виде метеоризма, умеренно выраженной диареи и запорам, чувству распирания после приема пищи, мигрирующих неопределенных болей в животе, симптомам гиповитаминоза, изжоги и отрыжке. А причиной недостатка кишечной палочки в организме могут стать различные социальные и биологичсекие факторы. Такие, например, как: переезд, изменения питания, влияние плохой экологии, стрессы, наркомания, алкоголизм, лечение антибиотиками, перенесенные или хронические заболевания.

— Но если кишечная палочка так важна, почему при расстройствах и других заболеваниях желудка обвиняют именно этот микроорганизм?

У бактерии есть и «темная сторона», определяющая способность кишечной палочки вызывать самые разнообразные поражения. Большинство представителей E.coli не проявляют выраженных патогенных свойств. Они способны вызвать заболевания лишь у крайне ослабленных людей с выраженными нарушениями иммунного статуса. Тем не менее, существуют представители кишечной палочки, получившие в ходе своей эволюции ряд свойств, позволяющих их отнести к патогенным микроорганизмам. Среди поражений у человека, вызванных E.coli, различают: кишечные (коли-инфекции) и внекишечные. Наиболее часто эти бактерии вызывают диареи, инфекции мочевыводящих путей, бактеримии и даже менингиты.

Основной механизм передачи кишечной палочки – фекально-оральный. Пути передачи — пищевой, водный, контактно-бытовой (грязные руки, предметы обихода и т.д.)

В передаче патогенных кишечных палочек между людьми главное значение имеют больные люди и бактерионосители. Поскольку многие животные выступают природными хозяевами E.coli, от них бактерии могут попадать в различные продукты, а оттуда – в организм человека.

Несмотря на традиционно сложившееся представление о «безвредности» кишечной палочки, она становится достаточно частой причиной заболеваемости как пациентов с иммунодифицитами, так и лиц с нормальным иммунным статусом.

— Какой анализ необходимо сдать для определения показателей кишечной палочки в организме?

Хочется отметить, что самолечением заниматься не стоит. В случае недомогания необходимо сразу обратиться к врачу. Он назначит вам следующие виды анализов: анализ на тифо-паратифозную группу и дисбиоз. Настоятельно рекомендуется пройти эти анализы до начала приема антибиотиков. Анализ на тифопаратифозную группу выполняется от 3 до 5 дней, на дисбиоз — 7 дней.

 

Номер бактериологического исследования на возбудителей тифо-паратифозной и дизентерийной групп микроорганизмов, патогенные эшерихии — 04-01-724

Номер исследования на Дисбиоз кишечника — 04-01-700

 

Фото из Архива лаборатории Explana

Кишечная палочка под микроскопом

1000 кратное увеличение

 

Фото из Архива лаборатории Explana

Кишечная палочка в чашке Петри.

Объективно о псевдонаучном. Темные поля крови: Диагностика

ВАЖНО!

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Темные поля крови: Диагностика / Автор: Алексей Водовозов
Источник: Популярная механика / Январь 2010

Кровь – удивительное творение природы. Можно без преувеличения сказать, что она является источником жизни. Ведь именно через кровь мы получаем кислород и питательные вещества, именно с кровью уносятся из клеток «отходы производства». Любой недуг обязательно находит свое отражение в крови. На этом построен целый ряд диагностических методик. И шарлатанских тоже.

Кровь была одной из первых жидкостей, которую любознательные медики поместили под только что изобретенный микроскоп. С тех пор прошло более 300 лет, микроскопы стали намного совершеннее, но глаза врачей по-прежнему смотрят на кровь в окуляры, выискивая признаки патологии.

На стекле

Антони ван Левенгук определенно получил бы несколько Нобелевских премий, живи он в наше время. Но в конце XVII века этой награды не было, поэтому Левенгук довольствуется всемирной известностью конструктора микроскопов и славой основателя научной микроскопии. Добившись в своих приборах 300-кратного увеличения, он сделал множество открытий, в том числе первым описал эритроциты.

Последователи Левенгука довели его детище до совершенства. Современные оптические микроскопы способны давать увеличение до 2000 раз и позволяют рассматривать прозрачные биологические объекты, включая клетки нашего организма.

Другой нидерландец – физик Фриц Цернике – в 1930-х годах заметил, что ускорение прохождения света по прямой делает изображение изучаемой модели более детальным, выделяя отдельные элементы на светлом фоне. Для создания интерференции в образце Цернике придумал систему колец, которые располагались как в объективе, так и в конденсаторе микроскопа. Если правильно настроить (юстировать) микроскоп, то волны, которые идут от источника света, будут попадать в глаз с определенным смещением по фазе. И это позволяет значительно улучшить изображение изучаемого объекта.

Метод получил название фазово-контрастной микроскопии иоказался настолько прогрессивным иперспективным для науки, что в 1953 году Цернике была присуждена Нобелевская премия по физике сформулировкой «За обоснование фазово-контрастного метода, особенно за изобретение фазово-контрастного микроскопа». Почему это открытие так высоко оценили? Раньше, чтобы рассмотреть под микроскопом ткани имикроорганизмы, их приходилось обрабатывать различными реактивами– фиксаторами и красителями. Живые клетки при таком раскладе увидеть не получалось, химикаты просто убивали их. Изобретение Цернике открыло в науке новое направление – прижизненное микроскопирование.

В XXI веке биологические и медицинские микроскопы стали цифровыми, способными работать в разных режимах – как в фазовом контрасте, так и в темном поле (изображение формируется светом, дифрагированным на объекте, и в результате объект выглядит очень светлым на темном фоне), а также в поляризованном свете, который нередко позволяет выявлять структуру объектов, лежащую за пределами обычного оптического разрешения.

Казалось бы, медикам нужно радоваться: в их руки попал мощнейший инструмент изучения тайн и загадок человеческого организма. Но этот высокотехнологичный метод очень заинтересовал не только серьезных ученых, но и шарлатанов и мошенников от медицины, которые посчитали фазово-контрастное и темнопольное микроскопирование очень удачным способом выуживания энных сумм денег у доверчивых граждан.

Она живая и шевелится

У пациента, который решится пройти обследование методом «Диагностика по живой капле крови» (варианты названия – «Тестирование на темнопольном микроскопе» или «Гемосканирование»), берут каплю крови, не окрашивают, не фиксируют, наносят на предметное стекло и изучают, просматривая образец на экране монитора. По результатам исследования ставятся диагнозы и назначается лечение.

Гемосканирование можно считать венцом творения мошеннической мысли, шедевром и высшим пилотажем околомедицинского шарлатанства. Во-первых, используется реально существующее физическое явление (про Нобелевку помните?) и самая настоящая сложная медицинская аппаратура. И действительно дорогостоящая. Стоимость диагностического комплекса обходится не менее чем в 3–4 тысячи долларов, и продают его солидные поставщики серьезной медицинской техники. Аппаратура имеет все необходимые – подлинные и совершенно заслуженные – сертификаты и свидетельства. Во-вторых, никаких проблем с лицензированием. Лабораторная диагностика – вполне законный вид медицинской деятельности, а микроскоп, позволяющий осуществлять фазово-контрастное или темнопольное микроскопирование,– вполне законная медицинская диагностическая аппаратура. Мало того, она широко применяется в медицине, то есть существуют сертифицированные и дипломированные специалисты. В-третьих, действительно под микроскопом можно обнаружить массу признаков тех или иных заболеваний. Например, изменение формы эритроцитов при серповидноклеточной анемии. А еще можно увидеть внутриклеточных паразитов все в тех же эритроцитах, бартонеллами называются. И даже яйца гельминтов в крови теоретически обнаружить можно.

Арба вижу – арба пою

Так в чем же подвох? В интерпретации. В том, как объясняют «темнопольщики» те или иные изменения вкрови, как называют обнаруженные артефакты, какие диагнозы ставят ичем лечат. Разобраться в том, что это обман, сложно даже врачу. Нужна специальная подготовка, опыт работы с образцами крови, сотни просмотренных «стекол» – как крашеных, так и «живых». Как в обычном поле, такивтемном. К счастью, у автора статьи такой опыт имеется, как имеется он иутех экспертов, с которыми сверялись результаты расследования.

Правильно говорится – лучше один раз увидеть. И своим глазам человек поверит куда быстрее, чем всем устным увещеваниям. На это и рассчитывают «лаборанты». К микроскопу подсоединен монитор, который отображает все, что видно в мазке. Вот вы лично когда последний раз видели собственные эритроциты? Вот то-то и оно. Интересно ведь. А пока завороженный посетитель любуется клетками родной любимой крови, «лаборант» начинает интерпретировать то, что он видит. Причем делает это по принципу акына: «Арба вижу– арба пою». Про какую «арбу» могут напеть шарлатаны, подробно читайте во врезке.

После того как пациент будет напуган и сбит с толку непонятными, аиногда и откровенно страшными картинками, ему объявляют «диагнозы». Чаще всего много, и один кошмарнее другого. Например, расскажут, что плазма крови инфицирована грибками или бактериями. Неважно, что увидеть их даже при таком увеличении достаточно проблематично, а уж отличить друг от друга– тем более. Микробиологам приходится сеять возбудителей различных болезней на специальные питательные среды, чтобы потом можно было точно сказать, кто вырос, к каким антибиотикам чувствителен и т.д. Микроскопия в лабораторных исследованиях применяется, но либо со специфичными красителями, либо вообще с флуоресцирующими антителами, которые прикрепляются к бактериям и таким образом делают их видимыми.

Но даже если, чисто теоретически, в крови под микроскопом будет обнаружен такой гигант мира бактерий, как кишечная палочка (1–3 мкм длиной и 0,5–0,8 мкм шириной), это будет означать только одно: у пациента сепсис, заражение крови. И он должен лежать горизонтально с температурой под 40 и прочими признаками тяжелейшего состояния. Потому что внорме кровь стерильна. Это одна из основных биологических констант, которая проверяется достаточно просто– посевом крови на различные питательные среды.

А еще могут рассказать, что кровь «закислена». Смещение рН (кислотности) крови, называемое ацидозом, действительно встречается при многих заболеваниях. Вот только измерять кислотность на глаз пока никто не научился, нужен контакт датчика сисследуемой жидкостью. Могут обнаружить «шлаки» и рассказать про степени зашлакованности организма по данным ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения). Но если поискать по документам на официальном сайте этой организации, то ни про шлаки, ни про степени зашлакованности там ни слова нет. Среди диагнозов могут встречаться синдром обезвоживания, синдром интоксикации, признаки ферментопатии, признаки дисбактериоза и масса других, не имеющих отношения либо к медицине, либо кданному конкретному больному.

Апофеоз диагностики, конечно же, назначение лечения. Оно, по странному стечению обстоятельств, будет проводиться биологически активными добавками к пище. Которые по сути ипо закону лекарствами не являются и лечить не могут в принципе. Тем более такие страшные болезни, как грибковый сепсис. Но гемосканеров это не смущает. Ведь лечить они будут не человека, а те самые диагнозы, которые ему наставлены с потолка. Ипри повторной диагностике – будьте уверены – показатели улучшатся.

Что нельзя увидеть в микроскоп

Что бы вам ни говорили «специалисты», с помощью микроскопа в капле крови, взятой из пальца, нельзя увидеть pH крови; дефицит ферментов для расщепления белков; уровень водно-солевого обмена; пищевые мутагенные/тератогенные токсины; поражение эритроцитов почечными токсинами / свободными радикалами; паразитов, грибы, бактерии, яйца глистов, цисты; активность, количество и качество иммунных клеток.

Тестирование по «живой капле крови» зародилось в США в 1970-х годах. Постепенно медицинской общественности и регулирующим органам стала ясна истинная сущность и ценность методики. С 2005 года началась кампания по запрету этой диагностики как мошеннической и не имеющей отношения к медицине. «Пациента обманывают трижды. Первый раз– когда диагностируют болезнь, которой нет. Второй раз– когда назначают долгое и дорогостоящее лечение. И третий раз– когда подделывают повторное исследование, которое обязательно будет свидетельствовать либо об улучшении, либо о возврате к норме» (доктор Стивен Баррет, вице-президент Американского национального совета против медицинского мошенничества, научный консультант Американского совета по науке и здоровью).

Взятки гладки?

Доказать, что вас обманули, практически нереально. Во-первых, как уже говорилось, не всякий врач сможет заподозрить в методике подлог. Во-вторых, даже если пациент пойдет в обычный диагностический центр и у него там ничего не найдут, можно в крайнем случае свалить все на врача-оператора, проводившего диагностику. И действительно, визуальная оценка сложных изображений целиком и полностью зависит от квалификации и даже физического состояния того, что проводит оценку. То есть метод не является достоверным, поскольку напрямую зависит от человеческого фактора. В-третьих, всегда можно сослаться на некие тонкие материи, которые пациенту понять не дано. Это последний рубеж, на котором обычно насмерть стоят все околомедицинские мошенники.

Что же мы имеем в сухом остатке? Непрофессиональных лаборантов, которые выдают случайные артефакты (аможет, и срежиссированные) вкапле крови за страшные заболевания. Ипотом предлагают лечить их пищевыми добавками. Естественно, все это за деньги, и очень немаленькие.

Имеет ли данная методика диагностическую ценность? Имеет. Безусловно. Такую же, как и традиционная микроскопия мазка. Можно увидеть, например, серповидноклеточную анемию. Или перницитозную анемию. Или другие действительно серьезные заболевания. Только вот, к огромному сожалению мошенников, встречаются они редко. Да и не продашь таким пациентам толченый мел с аскорбинкой. Им нужно настоящее лечение.

А так – все очень просто. Обнаруживаем несуществующую болезнь, а потом успешно ее излечиваем. Все довольны, особенно доволен вон тот гражданин, у которого из крови изгнали обломок антенны космической связи комара-звонца… И никому не жалко пущенных на ветер, а точнее, на обогащение мошенников, денег.

Впрочем, не всем. Некоторые отстаивают свои права во всех возможных инстанциях. В распоряжении автора есть копия письма Управления Росздравнадзора по Краснодарскому краю, куда обратились пострадавшие от гемосканирующих «врачей». Пациенту была диагностирована куча болезней, которые предлагалось лечить не меньшей кучей биологически активных добавок к пище. По результатам проверки выяснилось, что медицинское учреждение, проводившее диагностику, нарушает лицензионные требования, не заключает договор на оказание платных услуг (врач берет деньги наличными), нарушаются правила ведения медицинской документации. Были выявлены и другие нарушения.

Цитатой из письма Центрального аппарата Росздравнадзора и хотелось бы закончить статью: «Методика ‘Гемосканирование’ на рассмотрение иполучение разрешения на применение в качестве новой медицинской технологии в Росздравнадзор не представлялась и не разрешена кприменению в медицинской практике». Яснее не скажешь.

ВАЖНО!

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Интерфейс программы обработки СЗМ-изображений НТ-МДТ


Обработка СЗМ-изображений

Главное окно модуля

Сканированное изображение занимает максимально возможный размер по вертикали, благодаря перемещению панели инструментов и общей оптимизации рабочего пространства.

На панели инструментов расположены часто используемые инструменты выделения области, преобразования и анализа изображения.


У шкалы оси z можно перемещать концы отображаемого диапазона (треугольники) и весь выбранный диапазон в пределах максимального (как скроллбар). При необходимости можно открыть вспомогательную гистограмму, которая сделана на полупрозрачном фоне, чтобы ее можно было оставить на экране.

Гистограмму на прозрачном фоне можно быстро включить и отключить

Все преобразования изображения осуществляются с помощью панели инструментов или фильтров, вызванных из меню. Фильтры применяются для выравнивания плоскости изображения, снижения уровня шума, повышения резкости и для решения специальных задач.

Все фильтры накладываются на изображение, не изменяя исходные данные сканирования. Видна вся цепочка фильтров, благодаря чему всегда понятно, какие преобразования и в каком порядке были применены — это повышает доверие к результатам исследования и является частью научной этики.

Каждый фильтр имеет свою иконку, отображающую параметры, маску наложения или результат работы фильтра. Для иллюстрации поворота и зеркального отображения используется квадратик с несимметричной буквой F (filter). Названия фильтров в списке также содержат значения параметров, например, rotate by −13°, Fit lines (order 2, horizontal)

Простым перетаскиванием можно изменить порядок применения фильтров, любой из них можно временно отключить. У каждого фильтра есть маска наложения, т. е. области, на которые воздействует фильтр. Параметры фильтра настраиваются в отдельном окне, при этом используется режим предварительного просмотра.

Это могут быть самые подробные изображения живых бактерий крупным планом, сделанные на сегодняшний день

Всегда есть что исследовать и понять. Это верно, если вы отдаляете изображение от дальних уголков Вселенной или приближаете крошечные организмы. В науке, чем больше вопросов вы отвечаете, тем больше вы обнаруживаете, что нужно задать.

 

Итак, исследователи направили свои мощные микроскопы на защитную «кожу» бактерий, заглянув в глубины организации этой мембраны, раскрывая больше деталей, чем когда-либо прежде.

Грамотрицательные бактерии, такие как Escherichia  coli , имеют внешние мембраны, которые удерживают их внутренности на месте и защищают их от шума и суеты бактериальной жизни. Эти мембраны имеют потрясающий набор инструментов, включая белки внешней мембраны и токсины, такие как липополисахариды, усеивающие поверхность.

Но как только вы это узнаете, у вас возникнет еще больше вопросов – как все это сказочное сочетается друг с другом? Каково соотношение «шпильки» к мембране во всей бактерии? Вот тут-то и появляются новые исследования.

«Внешняя мембрана представляет собой мощный барьер против антибиотиков и является важным фактором, делающим инфекционные бактерии устойчивыми к лечению. Однако остается относительно неясным, как создается этот барьер, поэтому мы решили изучить его так подробно. », — объяснил биофизик и старший автор Университетского колледжа Лондона Барт Хугенбум.

«Изучая живые бактерии от молекулярного до клеточного масштаба, мы можем увидеть, как мембранные белки образуют сеть, которая охватывает всю поверхность бактерий, оставляя небольшие промежутки для участков, не содержащих белка.»

 

Исследователи использовали для этой задачи атомно-силовой микроскоп, представляющий собой микроскоп, который непрерывно исследует поверхность мембраны, чтобы определить ее форму. Это немного похоже на чтение по Брайлю, за исключением того, что вместо кончиков пальцев используются лазеры.

Затем команда создала прекрасное изображение бактериальной мембраны, которое они называют самым четким изображением живых бактерий, показывающее плотность белков внешней мембраны на поверхности

Атомно-силовая микроскопия, показывающая внешнюю мембрану.(Бенн и др., PNAS, 2021)

Как видно на изображении выше, на поверхности много крошечных отверстий. Это бета-бочкообразные белки, называемые поринами, которые образуют туннели через мембрану бактерий, позволяя молекулам диффундировать через них. Между тем, небольшие участки гладкой поверхности — это липополисахариды, которые могут расширяться по мере роста клетки.

«Мы пришли к выводу, что внешняя мембрана представляет собой мозаику из разделенных фаз областей, богатых липополисахаридами, и областей, богатых белками внешней мембраны, поддержание которых необходимо для целостности мембраны и, следовательно, для образа жизни грамотрицательных бактерия», — пишет команда в новой статье.

 

Конечно, ученые не смотрят на E. coli в огромные микроскопы просто ради удовольствия, как бы это ни было приятно. У нас есть веские причины нуждаться в таком уровне детального понимания.

«На изображении наружной мембраны бактерий из учебника показаны белки, распределенные по мембране неупорядоченным образом, хорошо смешанные с другими строительными блоками мембраны. Наши изображения показывают, что это не так, а липидные участки отделены от сети, богатые белком, подобно тому, как масло отделяется от воды, в некоторых случаях образуя щели в панцире бактерий», — объясняет первый автор и биохимик UCL Джорджина Бенн.

«Этот новый взгляд на внешнюю мембрану означает, что теперь мы можем приступить к изучению того, имеет ли такой порядок значение для функции, целостности и устойчивости к антибиотикам, и если да, то каким образом».

Команда будет исследовать, как мы можем использовать эти новые знания, чтобы перехитрить устойчивость к противомикробным препаратам у грамотрицательных бактерий, таких как E. coli .

Подобно звездам или черным дырам в далеких галактиках, когда вы что-то нашли, всегда возникает больше вопросов, на которые нужно ответить.

Исследование опубликовано в PNAS .

 

Изображения нитчатых клеток E. coli и…

Контекст 1

… нитчатых клеток E. coli (рис. 1А) с полиэлектролитами PSS и PAH с последующей обработкой депротеинизирующим раствором NaOCl привело к образованию нитевидных трубок (рис. 1С). Приблизительно одна капсула с покрытием на срез изображения все еще содержала бактерии (рис. 1D). …

Контекст 2

… нитчатых клеток E. coli (рис. 1А) полиэлектролитами PSS и ПАУ с последующей обработкой депротеинизирующим раствором NaOCl приводило к образованию нитевидных трубочек (рис. 1С). Приблизительно одна капсула с покрытием на срез изображения все еще содержала бактерии (рис. 1D). …

Контекст 3

… нитчатых клеток E. coli (рис. 1А) полиэлектролитами PSS и ПАУ с последующей обработкой депротеинизирующим раствором NaOCl приводило к образованию нитевидных трубочек (рис. 1С).Приблизительно одна капсула с покрытием на срез изображения все еще содержала бактерии (рис. 1D). …

Контекст 4

… для сравнения, флуоресцентные красители слабо связывались с полиэлектролитными капсулами без белкового покрытия, как показано с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 2C, D). Световой микроскоп анализ полых полиэлектролитных капсул с полимерным покрытием S-слоя показывает почти такие же пропорции, но мало различий с непокрытыми полиэлектролитными пробирками (рис. 1D). Эти полиэлектролитные капсулы с S-слоем, по-видимому, имеют более компактные стенки трубки, чем капсулы без белков (рис. 1C, рис. 1D)….

Context 5

… микроскопический анализ полых полиэлектролитных капсул с полимерным покрытием S-слоя показывает почти такие же пропорции, но мало различий с полиэлектролитными пробирками без покрытия (рис. 1D). Эти полиэлектролитные капсулы с S-слоем, по-видимому, имеют более компактные стенки трубки, чем капсулы без белков (рис. 1C, рис. 1D). …

Context 6

… микроскопический анализ полых полиэлектролитных капсул с полимерным покрытием S-слоя показывает почти такие же пропорции, но мало различий с полиэлектролитными пробирками без покрытия (рис. 1D).Эти полиэлектролитные капсулы с S-слоем, по-видимому, имеют более компактные стенки трубки, чем капсулы без белков (рис. 1C, рис. 1D). …

Контекст 7

… после добавления восстановителя коричневатый цвет изменился на черный, что указывает на образование Pd(0). Полиэлектролитные пробирки с S-слойным покрытием и частицами синтезированного палладия видны на рис. 1E, рис. 3C и рис. 4B, однако частицы были идентифицированы отдельно на рис. 3C и рис. 4B. Эти пробирки имеют однородную темную поверхность, что указывает на присутствие Pd (0) (рис. 1Е) и в среднем 1-1.3 мкм в диаметре и 5-50 мкм в длину (рис. 4В). …

Контекст 8

… полиэлектролитные пробирки с покрытием из частиц синтезированного палладия видны на рис. 1E, рис. 3C и рис. 4B, однако частицы были идентифицированы отдельно на рис. 3C и рис. 4B. Эти трубки имеют однородную темную поверхность, что указывает на присутствие Pd (0) (рис. 1E), и имеют в среднем 1-1,3 мкм в диаметре и 5-50 мкм в длину (рис. 4B). Чтобы получить больше информации о формировании частиц, внешнем виде поверхности, а также внутренней части капсул, материалы были исследованы с помощью SEM, EDX и TEM.

Контекст 9

… ссылка, капсулы без белкового покрытия использовали в качестве матрицы для синтеза частиц Pd(0). Эти материалы представлены на рисунке 1F, рисунке 3A и рисунке 4A. Эти трубки имеют диаметр 0,8-1,1 мкм и длину 5-50 мкм. …

сравнение с фазово-контрастными и электронно-микроскопическими изображениями.

J Бактериол. 1985 г., февраль; 161(2): 478–483.

Эта статья была процитирована другими статьями в PMC.

Abstract

С помощью фазово-контрастного микроскопа, конфокального сканирующего светового микроскопа и электронного микроскопа исследовали нуклеоид живых и фиксированных OsO4- или глутаральдегидом клеток штаммов Escherichia coli.Достоверность изображений, полученных с помощью конфокального сканирующего светового микроскопа, исследовали путем сравнения с фазово-контрастными микрофотографиями и реконструкциями на основе серийно срезанного материала ДНК-содержащих и безДНК-клеток. Это сравнение показало более высокое разрешение конфокального сканирующего светового микроскопа по сравнению с фазово-контрастным микроскопом и согласие с результатами, полученными с помощью электронного микроскопа. Влияние фиксации на структуру нуклеоида изучали у E.coli B/r h366. Конфокальные сканирующие световые микрофотографии и электронно-микроскопические реконструкции показали, что форма нуклеоида остается аналогичной после фиксации OsO4 или глутаральдегида; однако нуклеоид OsO4 оказался несколько меньшим и более централизованным внутри клетки.

Полный текст

Полный текст доступен в виде отсканированной копии оригинальной печатной версии. Получите копию для печати (файл PDF) полной статьи (2,7M) или щелкните изображение страницы ниже, чтобы просмотреть страницу за страницей.Ссылки на PubMed также доступны для Selected References .

Изображения в этой статье

Нажмите на изображение, чтобы увеличить его.

Избранные ссылки

Эти ссылки находятся в PubMed. Возможно, это не полный список литературы из этой статьи.

  • Биннертс Дж. С., Волдринг С. Л., Бракенхофф Г. Дж. Визуализация нуклеоида в живых бактериях на поверхностях, покрытых полилизином, методом иммерсии. Дж Микроск.1982 г., март; 125 (часть 3): 359–363. [PubMed] [Google Scholar]
  • Данео-Мур Л., Дикер Д., Хиггинс М.Л. Структура нуклеоида в клетках Streptococcus faecalis. J Бактериол. 1980 г., февраль; 141 (2): 928–937. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Grond CJ, Derksen J, Brakenhoff GJ. Характер полос сегмента 46A-48C в политенных хромосомах Drosophila hydeï, изученный с помощью конфокальной сканирующей световой микроскопии (CSLM). Разрешение ячейки опыта. 1982 г., апрель; 138 (2): 458–462. [PubMed] [Google Scholar]
  • Helmstetter CE.Синтез ДНК во время цикла деления быстрорастущей кишечной палочки B/r. Дж Мол Биол. 1968 г., 14 февраля; 31 (3): 507–518. [PubMed] [Google Scholar]
  • KELLENBERGER E, RYTER A, SECHAUD J. Электронно-микроскопическое исследование ДНК-содержащих плазм. II. ДНК вегетативных и зрелых фагов в сравнении с нормальными бактериальными нуклеоидами в различных физиологических состояниях. J Биофиз Биохим Цитол. 1958 г. , 25 ноября; 4 (6): 671–678. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Margaretten W, Morgan C, Rosenkranz HS, Rose HM.Влияние гидроксимочевины на развитие вируса. I. Электронно-микроскопическое исследование влияния на развитие бактериофага Т4. J Бактериол. 1966 г., февраль; 91 (2): 823–833. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • MASON DJ, POWELSON DM. Деление ядер, наблюдаемое у живых бактерий новым методом. J Бактериол. 1956 г., апрель; 71 (4): 474–479. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Morgan C, Rosenkranz HS, Carr HS, Rose HM. Электронная микроскопия кишечной палочки, обработанной хлорамфениколом.J Бактериол. 1967 г., июнь; 93 (6): 1987–2002 гг. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Nanninga N, Woldringh CL. Интерпретация химически фиксированной и лиофилизированной бактериальной нуклеоплазмы. Приложение Acta Histochem. 1981; 23:39–53. [PubMed] [Google Scholar]
  • Orr E, Fairweather NF, Holland IB, Pritchard RH. Выделение и характеристика штамма, несущего условно-летальную мутацию в гене cou Escherichia coli K12. Мол Ген Жене. 1979;177(1):103–112. [PubMed] [Google Scholar]
  • REYNOLDS ES.Использование цитрата свинца при высоком pH в качестве непрозрачного для электронов красителя в электронной микроскопии. Джей Селл Биол. 1963 апр; 17: 208–212. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • SCHAECHTER M, WILLIAMSON JP, HOOD JR, Jr, KOCH AL. Рост, деление клеток и ядер у некоторых бактерий. J Gen Microbiol. 1962 ноябрь; 29: 421–434. [PubMed] [Google Scholar]
  • Сешо Дж., Келленбергер Э. Электронная микроскопия ДНК-содержащих плазм. IV. Фиксация инфицированных вирусом бактерий глутаральдегид-уранилацетатом для получения тонких срезов.J Ultrastruct Res. 1972 г., июнь; 39 (5): 598–607. [PubMed] [Google Scholar]
  • Valkenburg JA, Woldringh CL. Разделение фаз между нуклеоидом и цитоплазмой в Escherichia coli по данным иммерсивной рефрактометрии. J Бактериол. 1984 г. , декабрь; 160 (3): 1151–1157. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Woldringh CL. Морфологический анализ разделения ядер и деления клеток в жизненном цикле кишечной палочки. J Бактериол. 1976 г., январь; 125 (1): 248–257. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Woldringh CL, Nanninga N.Организация нуклеоплазмы в Escherichia coli визуализируется с помощью фазово-контрастной световой микроскопии, замораживания и тонких срезов. J Бактериол. 1976 г., сен; 127 (3): 1455–1464. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Zusman DR, Carbonell A, Haga JY. Конденсация нуклеоидов и деление клеток Escherichia coli MX74T2 ts52 после ингибирования синтеза белка. J Бактериол. 1973 г., сен; 115 (3): 1167–1178. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Статьи из Journal of Bacteriology предоставлены здесь с разрешения Американского общества микробиологии (ASM)


Электронно-микроскопическое исследование липополисахарида птичьего штамма Escherichia coli O18

J Бактериол. 1970 июль; 103(1): 238–243.

a Факультет биологии Университета Ватерлоо, Ватерлоо, Онтарио, Канада

1 Текущий адрес: Кафедра микробиологии Медицинского центра Университета Коннектикута, Фармингтон, Коннектикут.

Эта статья была процитирована другими статьями в PMC.

Abstract

Методом электронной микроскопии исследована тонкая структура липополисахарида (ЛПС), выделенного из птичьего штамма Escherichia coli O18.В положительно окрашенных препаратах наблюдались лентовидные структуры с частым разветвлением, как сообщалось ранее (4). Иногда можно было увидеть две плотно окрашенные параллельные линии, связанные с лентой. При отрицательном окрашивании ЛПС выглядел как ветвящаяся лента с одной центральной и двумя боковыми зонами, разделенными двумя относительно густыми параллельными линиями, проходящими по всей длине ленты. Боковые зоны, вероятно, были связаны с О-антигенными боковыми цепями ЛПС. Эта интерпретация подтверждается тем фактом, что электронно-микроскопическая структура ЛПС двух шероховатых штаммов E. coli K-12 Gal 23 и Salmonella tuphimurium TV119 RII, лишенные О-специфических боковых цепей, не имели внешних боковых зон.

Полный текст

Полный текст доступен в виде отсканированной копии оригинальной печатной версии. Получите копию для печати (файл PDF) полной статьи (1,8 Мб) или щелкните изображение страницы ниже, чтобы просмотреть страницу за страницей. Ссылки на PubMed также доступны для Selected References .

Изображения в этой статье

Нажмите на изображение, чтобы увеличить его.

Избранные ссылки

Эти ссылки находятся в PubMed. Возможно, это не полный список литературы из этой статьи.

  • BANGHAM AD, HORNE RW. НЕГАТИВНОЕ ОКРАШИВАНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ И ИХ СТРУКТУРНАЯ МОДИФИКАЦИЯ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ, НАБЛЮДАЕМЫЕ В ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ. Дж Мол Биол. 1964 г., май; 8: 660–668. [PubMed] [Google Scholar]
  • Beer H, Braude AI, Brinton CC., Jr Исследование размеров, форм и токсичности частиц, присутствующих в эндотоксичном препарате boivin-типа. Энн Н.Ю. Академия наук. 1966 г., 30 июня; 133 (2): 450–475. [PubMed] [Google Scholar]
  • BLADEN HA, MERGENHAGEN SE. УЛЬТРАСТРУКТУРА VEILLONELLA И МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ СВЯЗЬ НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ С ЧАСТИЦАМИ, СВЯЗАННЫМИ С ЭНДОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ. J Бактериол. 1964, ноябрь; 88: 1482–1492. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • LUCY JA, GLAUERT AM. СТРУКТУРА И СБОРКА МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ЛИПИДНЫХ КОМПЛЕКСОВ, СОСТОЯЩИХ ИЗ ГЛОБУЛЯРНЫХ МИЦЕЛЛ. Дж Мол Биол. 1964 г., май; 8: 727–748. [PubMed] [Google Scholar]
  • McIntire FC, Sievert HW, Barlow GH, Finley RA, Lee AY.Химические, физические, биологические свойства липополисахарида из кишечной палочки К-235. Биохимия. 1967 г., август; 6 (8): 2363–2372. [PubMed] [Google Scholar]
  • МИЛНЕР К.С., АНАКЕР Р.Л., ФУКУШИ К., ХАСКИНС В.Т., ЛЭНДИ М., МАЛЬМГРЕН Б., РИБИ Э. СИМПОЗИУМ ПО СВЯЗИ СТРУКТУРЫ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИХ ИММУНОЛОГИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ. III. СТРУКТУРА И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОВЕРХНОСТНЫХ АНТИГЕНОВ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ. Bacteriol Rev. 1963, декабрь; 27: 352–368. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Rapin AM, Mayer H.Комплексные полисахариды у разных штаммов кишечной палочки К-12. Энн Н.Ю. Академия наук. 1966 г., 30 июня; 133 (2): 425–437. [PubMed] [Google Scholar]
  • Rothfield L, Horne RW. Реассоциация очищенного липополисахарида и фосфолипида оболочки бактериальной клетки: электронно-микроскопические и монослойные исследования. J Бактериол. 1967 г., май; 93 (5): 1705–1721. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Шандс Дж. В., младший, Грэм Дж. А., Нэт К. Морфологическая структура изолированного бактериального липополисахарида.Дж Мол Биол. 1967 г., 14 апреля; 25 (1): 15–21. [PubMed] [Google Scholar]
  • WEIDEL W, FRANK H, MARTIN HH. Жесткий слой клеточной стенки штамма Escherichia coli B. J Gen Microbiol. 1960, февраль; 22: 158–166. [PubMed] [Google Scholar]
  • Работа Э., Нокс К.В., Веск М. Химия и электронная микроскопия внеклеточного липополисахарида из Escherichia coli. Энн Н.Ю. Академия наук. 1966 г., 30 июня; 133 (2): 438–449. [PubMed] [Google Scholar]

Статьи из Journal of Bacteriology предоставлены Американским обществом микробиологии (ASM)


Подготовленные препараты для бактериологического микроскопа

    Bacillus subtilis, сено, почва
Эта бактерия известна как сенная палочка или травяная палочка.Он имеет форму палочки и находится в кишечнике человека. Подготовленное микроскопическое слайд-изображение Bacillus Subtilis слева было получено при 400-кратном увеличении. Узнайте больше здесь.
    Кишечная палочка
E. Coli под микроскопом при увеличении 400х. Кишечная палочка (Escherichia Coli) представляет собой грамотрицательную палочковидную бактерию. Большинство штаммов E. Coli безвредны, но некоторые серотипы могут вызывать пищевое отравление у своих хозяев.Безвредные штаммы являются частью нормальной микрофлоры кишечника. Узнайте больше о кишечной палочке здесь.
    Helicobacter Pylori
Подготовленное микроскопическое слайд-изображение Helicobacter Pylori слева было получено при 400-кратном увеличении. Helicobacter Pylori — грамотрицательная бактерия, связанная с развитием язвы двенадцатиперстной кишки и рака желудка. Однако более 80% людей, инфицированных Helicobacter Pylori, не имеют симптомов, и было высказано предположение, что бактерия может играть важную роль в естественной экологии желудка.Узнайте больше здесь.
    Lactobacillus (йогуртовые бактерии)
Лактобациллы представляют собой грамположительные палочковидные бактерии, принадлежащие к группе молочнокислых бактерий. Большинство представителей этой группы бактерий превращают лактозу в сахар и молочную кислоту. Бактерии Lactobacillus, которые находятся во рту (не из бактерий йогурта), могут быть причиной кариеса и кариеса.Слайд, подготовленный микроскопом Lactobacillus слева, был снят с 400-кратным увеличением.
    Rhizobium Meliloti (азотфиксация в корнях бобовых)
Подготовленное под микроскопом Rhizobium Meliloti изображение слайда слева было получено при 400-кратном увеличении. Эта грамотрицательная азотфиксирующая бактерия, также известная как Sinorhizobium Meliloti, образует симбиотические отношения с бобовыми, что приводит к образованию нового органа растения, называемого корневым клубеньком.
    Сарчина
Sarcina — это грамположительная бактерия, которую можно обнаружить на коже человека или в толстом кишечнике. Подготовленное Sarcina предметное стекло слева было снято с 400-кратным увеличением.
    Стафилококк
Подготовленное под микроскопом стафилококковое изображение слайда слева было снято с 400-кратным увеличением.Эти грамположительные бактерии обычно безвредны и обитают на коже и слизистых оболочках. Стафилококковые инфекции вызываются штаммом этих бактерий.
    Туберкулез
Туберкулез — это заболевание, поражающее легкие и вызываемое Mycobacterium. Туберкулез — это очень слабые грамположительные бактерии, которые могут противостоять дезинфицирующим средствам и выживать в сухой среде в течение нескольких недель.Микроскопическое изображение туберкулеза слева было получено с 400-кратным увеличением. Узнайте больше о туберкулезе здесь.

Самые четкие изображения, когда-либо раскрывающие неоднородное лицо o

изображение: Микроскопическое изображение живой E.coli, обнаруживая пятнистую природу ее защитной наружной мембраны. Плотно упакованная сеть белков прерывается гладкими, свободными от белков островками (обозначены пунктирными линиями на вставке). посмотреть больше 

Авторы и права: Benn et al. УКЛ

Самые четкие изображения живых бактерий, которые когда-либо были получены исследователями UCL, раскрывают сложную структуру защитного слоя, который окружает многие бактерии и затрудняет их уничтожение антибиотиками.

Исследование, опубликованное сегодня в Трудах Национальной академии наук США и проведенное в сотрудничестве с учеными из Национальной физической лаборатории, Королевского колледжа Лондона, Оксфордского университета и Принстонского университета, показывает, что бактерии с защитными внешними слоями, называемые Грамотрицательные бактерии – могут иметь более сильные и более слабые пятна на своей поверхности.

Команда обнаружила, что защитная внешняя мембрана бактерий содержит плотные сети белковых строительных блоков, чередующихся с участками, которые, по-видимому, не содержат белков.Вместо этого эти участки обогащены молекулами с сахарными цепочками (гликолипидами), которые удерживают наружную мембрану плотной.

Это важное открытие, поскольку прочная внешняя мембрана грамотрицательных бактерий препятствует проникновению в клетку некоторых лекарств и антибиотиков: эта внешняя мембрана является одной из причин устойчивости таких бактерий к противомикробным препаратам (включая A. baumannii , P  aeruginosa и энтеробактерии, такие как Salmonella и E.coli ) в настоящее время считается большей угрозой, чем грамположительные бактерии, такие как устойчивый S. aureus (известный как MRSA).

«Внешняя мембрана представляет собой грозный барьер против антибиотиков и является важным фактором, делающим инфекционные бактерии устойчивыми к лечению. Однако остается относительно неясным, как устроен этот барьер, поэтому мы решили изучить его так подробно», — пояснил автор-корреспондент профессор Барт Хугенбум (Лондонский центр нанотехнологий в UCL и UCL Physics & Astronomy).

«Изучая живые бактерии от молекулярного до клеточного масштаба, мы можем увидеть, как мембранные белки образуют сеть, которая охватывает всю поверхность бактерий, оставляя небольшие промежутки для участков, не содержащих белка. Это говорит о том, что барьер не может быть одинаково трудно пробить или растянуть по всей бактерии, но может иметь более сильные и слабые места, которые также могут быть нацелены на антибиотики».

Чтобы лучше понять эту архитектуру, ученые провели крошечной иглой над живыми Escherichia coli ( E.coli ) бактерий, таким образом «чувствуя» их общую форму. Поскольку кончик иглы имеет ширину всего несколько нанометров, это позволило визуализировать молекулярные структуры на поверхности бактерий.

Полученные изображения показывают, что вся внешняя мембрана бактерий заполнена микроскопическими отверстиями, образованными белками, которые позволяют проникать питательным веществам, препятствуя проникновению токсинов. Хотя было известно, что внешняя мембрана содержит много белков, ее скученность и неподвижность оказались неожиданными.

Удивительно, но на изображениях также было обнаружено множество пятен, которые не содержали белков. Эти пятна содержат гликолипид, обычно обнаруживаемый на поверхности грамотрицательных бактерий. Кроме того, другой тип прыщеобразного пятна образовался, когда части мембраны были вывернуты наизнанку из-за мутаций. В этом случае появление этих дефектов коррелировало с повышенной чувствительностью к бацитрацину, антибиотику, обычно эффективному только против грамположительных, но не против грамотрицательных бактерий.

Как объяснила Джорджина Бенн, проводившая микроскопию бактерий в лаборатории профессора Хугенбума в Калифорнийском университете: «На изображении внешней мембраны бактерий из учебника показаны белки, распределенные по мембране неупорядоченным образом, хорошо смешанные с другими строительными блоками мембрана. Наши изображения демонстрируют, что это не так, а липидные пятна отделяются от богатых белком сетей точно так же, как масло отделяется от воды, в некоторых случаях образуя щели в панцире бактерий.Этот новый взгляд на внешнюю мембрану означает, что теперь мы можем начать исследовать, имеет ли такой порядок значение для функции мембраны, целостности и устойчивости к антибиотикам и как».

Команда также предполагает, что результаты могут помочь объяснить способы, с помощью которых бактерии могут поддерживать плотно упакованный защитный барьер, в то же время обеспечивая быстрый рост: обычная бактерия E. coli удваивается в размере, а затем делится за 20 минут при благоприятных условиях. Они предполагают, что гликолипидные участки могут допускать большее растяжение мембраны, чем белковые сети, что облегчает адаптацию мембраны к растущему размеру бактерии.

Работа выполнена при финансовой поддержке UKRI, Национальных институтов здравоохранения, Европейского исследовательского совета и Министерства бизнеса, энергетики и промышленной стратегии Великобритании.

Примечания для редакторов

Чтобы получить дополнительную информацию или поговорить с исследователями, пожалуйста, свяжитесь с доктором Ребеккой Кейгилл, UCL Media Relations. T: +44 (0)20 3108 3846 / +44 (0)7733 307 596, E: [email protected]    

Джорджина Бенн, Ирина В. Михеева, Патрик Джордж Иннс, Джоэл С.Forster, Nikola Ojkic, Christian Bortolini, Maxim G. Ryadnov, Colin Kleanthous, Thomas J. Silhavy и Bart W. Hoogenboom, « Фазовое разделение во внешней мембране Escherichia coli» будет опубликовано в Proceedings of the National Academy наук США (2021) в понедельник, 25 октября 2021 г., в 20:00 по британскому времени / 15:00 по восточному времени США и до этого времени находится под строгим эмбарго .

DOI для этой статьи будет 10.1073/pnas.2112237118, и после публикации он будет доступен здесь: https://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.2112237118

Изображение

Ссылка для скачивания: https://wetransfer.com/downloads/a26c4589346615b10810ff24a1adcdfa20211021083915/b82b4aef2d31a90b5e4f2c70bb41c94f20211021083915/970c17

Подпись: Микроскопическое изображение живой бактерии E. coli, демонстрирующее пятнистую природу ее защитной внешней мембраны. Плотно упакованная сеть белков прерывается гладкими, свободными от белков островками (обозначены пунктирными линиями на вставке).(Кредит: Бенн и др. UCL)

О UCL – Глобальном университете Лондона

UCL — это разнообразное сообщество со свободой бросать вызов и мыслить по-новому.

Наше сообщество, насчитывающее более 41 500 студентов из 150 стран и более 12 500 сотрудников, стремится к академическим успехам, преодолевает границы и положительно влияет на решение реальных проблем.

Мы неизменно входим в десятку лучших университетов мира и являемся одним из немногих учебных заведений, обладающих самой прочной академической репутацией и самым широким исследовательским вкладом.

У нас прогрессивный и комплексный подход к обучению и исследованиям, мы поддерживаем инновации, творчество и междисциплинарную работу. Мы учим наших студентов, как думать, а не что думать, и рассматриваем их как партнеров, сотрудников и участников.

На протяжении почти 200 лет мы гордимся тем, что открываем доступ к высшему образованию студентам из самых разных слоев общества и меняем способы создания и обмена знаниями.

Мы были первыми в Англии, которые приветствовали женщин в университетском образовании, и это мужественное отношение и разрушительный дух живы и сегодня.Мы УКЛ.

www.ucl.ac.uk| Подпишитесь на @uclnews в Твиттере | Смотрите наш канал на YouTube | Слушайте подкасты UCL на SoundCloud | Узнайте, что происходит в UCL Minds | #MadeAtUCL

 

 

 



Журнал

Труды Национальной академии наук

Метод исследования

Экспериментальное исследование

Предмет исследования

Ячейки

Название статьи

Разделение фаз во внешней мембране Escherichia coli

Дата публикации статьи

25 октября 2021 г.

Быстрое обнаружение Escherichia coli с помощью индуцированного бактериофагами лизиса и анализа изображений

Abstract

Быстрое обнаружение бактериальных патогенов является критической неудовлетворенной потребностью как в пищевых продуктах, так и в пробах окружающей среды, таких как оросительная вода.В рамках Закона о модернизации безопасности пищевых продуктов (FSMA) правило безопасности продукции установило несколько требований к тестированию на наличие родового штамма Escherichia coli в воде, но текущий метод, доступный для тестирования (EPA M1603), требует определенного количества колоний. проверку и высококвалифицированный персонал для проведения этих испытаний. Цель исследования заключалась в оценке индуцированного фагом бактериального лизиса с использованием количественного анализа изображений для быстрого обнаружения E . coli при низких концентрациях в течение 8 часов. Это исследование было направлено на разработку простого, но высокочувствительного и специфичного подхода к обнаружению целевых бактерий в сложных матрицах. В кабинете E . Клетки coli сначала обогащали трипсиновым соевым бульоном (TSB), после чего проводили индуцированный фагом T7 лизис, концентрацию, окрашивание и флуоресцентную визуализацию. Был проведен анализ изображения, включая предварительную обработку изображения, сегментацию изображения и количественный анализ клеточных морфологических признаков (площадь, эксцентриситет и полная ширина на половине максимума).Пробные эксперименты с использованием реалистичных матриц, включая имитацию воды для мытья свежих продуктов, кокосовой воды и воды для мытья шпината, продемонстрировали, что этот метод можно применять для использования в ситуациях, возникающих на предприятиях пищевой промышленности. Результаты показали E . Клетки coli , лизированные фагами Т7, продемонстрировали значительно (P <0,05) более высокое высвобождение внеклеточной ДНК, изменение клеточной формы (от палочковидной до круглой) и интенсивность диффузного флуоресцентного сигнала. Используя эту стратегию биосенсорного анализа, была достигнута чувствительность для обнаружения Escherichia coli при 10 КОЕ/мл в течение 8 часов как в лабораторной среде, так и в сложных матрицах.Предлагаемая стратегия биозондирования на основе фагов позволяет быстро обнаруживать бактерии и применима для анализа пищевых систем. Кроме того, этапы, включенные в этот анализ, могут быть автоматизированы, чтобы обеспечить обнаружение целевых бактерий в пищевых предприятиях без значительных ресурсов.

Образец цитирования: Yang X, Wisuthiphaet N, Young GM, Nitin N (2020) Быстрое обнаружение Escherichia coli с использованием индуцированного бактериофагами лизиса и анализа изображений. ПЛОС ОДИН 15(6): e0233853.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233853

Редактор: Читрита ДеРой, Пенсильванский государственный университет, США

Получено: 1 февраля 2020 г.; Принято: 13 мая 2020 г .; Опубликовано: 5 июня 2020 г.

Авторское право: © 2020 Yang et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и в его файлах вспомогательной информации.

Финансирование: Этот проект финансировался Программой USDA-NIFA по повышению безопасности пищевых продуктов с помощью усовершенствованных технологий обработки (A4131) с грантом №. 2015-68003-23411. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

В рамках Закона о модернизации безопасности пищевых продуктов (FSMA) Правила безопасности продуктов установили несколько стандартов для тестирования на присутствие родового штамма Escherichia coli в воде. Например, нет E . coli должен быть обнаружен в воде, которая непосредственно используется для контакта со свежими продуктами после сбора урожая или с поверхностями, контактирующими с пищевыми продуктами. Кроме того, сельскохозяйственная вода, применяемая для орошения сельскохозяйственных культур, должна содержать не более 126 колониеобразующих единиц (КОЕ) на 100 мл тестируемой воды [1].Чтобы соответствовать правилу безопасности продукции, чувствительные, экономичные и быстрые методы для E . Желательны обнаружение coli . В идеале метод для E . Обнаружение coli должно быть завершено в течение 8 часов, чтобы соответствовать типичному графику работы большинства операций по упаковке свежих продуктов с относительно коротким сроком годности [2]. Текущий метод для универсального E . Обнаружение coli в сельскохозяйственной воде основано на тесте U.S. Метод Агентства по охране окружающей среды 1603 (EPA M1603). Этот метод требует специальной проверки нескольких колоний и высококвалифицированного персонала для проведения теста. Кроме того, существует значительная субъективность в оценке ложноположительных результатов [3].

В дополнение к традиционным методам обнаружения, литические бактериофаги (фаги) также были оценены как биосенсорный элемент для обнаружения бактерий. Чрезвычайная специфичность фагов к своему хозяину обеспечивает естественное событие, которое может быть использовано в методе обнаружения бактериальных патогенов [4].Кроме того, быстрота размножения фага обеспечивает «встроенную» стадию амплификации, которую можно обнаружить в течение нескольких часов [5]. Основываясь на этих преимуществах, были разработаны различные технологии биосенсоров на основе фагов. Фаговое типирование — это классический культуральный метод, основанный на фагах, для выявления специфических бактериальных патогенов. Образование визуально наблюдаемой прозрачной бляшки указывает на присутствие бактериального хозяина, специфичного для добавленных фагов [6]. Оптический подход к детекции включает в себя контроль за уменьшением мутности с помощью спектрофотометра [7].Однако как визуальные, так и оптические методы требуют относительно большого количества клеток-хозяев, что может занять много времени. Обнаружение образования комплекса фаг-бактерия является еще одной стратегией биосенсорного анализа на основе фагов. Комплекс фаг-бактерия формируется при инфицировании с высокой специфичностью и стабильностью. Один из подходов к обнаружению комплекса заключается в флуоресцентной маркировке фагов с последующим поглощением фагов бактериями. Затем с помощью проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии можно обнаружить фаг-бактериальный комплекс [8–10].Анализ прост и понятен, но флуоресцентный сигнал только от фагов имеет низкое отношение сигнал/шум [11]. Другой метод биосенсорного анализа на основе фагов заключается в использовании репортерных фагов, которые несут генетически модифицированные репортерные гены для управления метаболическим процессом бактерий-хозяев [5]. В нескольких исследованиях эта концепция использовалась для разработки генетически модифицированных репортерных фагов для сверхэкспрессии β -галактозидазы или щелочной фосфатазы [12–14]. Однако современные подходы, основанные на репортерных фагах, могут усложнить и увеличить капитальные затраты на процесс обнаружения.

Как описано выше, были разработаны различные подходы к биосенсорному анализу на основе фагов, но каждый метод имеет некоторые ограничения. Настоящее исследование было направлено на разработку нового, быстрого и чувствительного обнаружения E . coli с помощью микроскопии и анализа изображений. Визуализация с использованием флуоресцентной микроскопии в сочетании с автоматическим анализом изображений является многообещающим альтернативным подходом, который позволяет повысить чувствительность и снизить сложность протоколов методов обнаружения бактерий.

Микроскопическая визуализация способна сфокусироваться на сигнале флуоресценции от отдельной бактериальной клетки; следовательно, он обеспечивает уровень чувствительности обнаружения одной клетки [15]. Внедрение визуализации и анализа изображений для обнаружения бактерий может привести к разработке методов обнаружения, требующих простой инструментальной настройки, такой как флуоресцентный микроскоп или даже миниатюрные версии микроскопа для обнаружения в полевых условиях. Процедура визуализации и анализ изображения могут быть автоматизированы, что обеспечивает простой и удобный протокол обнаружения, не требующий специализированного обученного персонала, а упрощенный протокол приводит к более быстрому обнаружению.

Кроме того, визуализацию и анализ изображений можно проводить в полевых условиях, поскольку не требуется асептическая среда, в отличие от подходов к обнаружению на основе нуклеиновых кислот, которые необходимо проводить в молекулярной лаборатории. В пищевой промышленности визуализация и анализ изображений обычно не используются для анализа безопасности пищевых продуктов и контроля качества, но этот подход широко используется в медицинских диагностических целях. В настоящее время для обнаружения малярийного паразита, Plasmodium , инфекции эритроцитов применяются процедуры визуализации, основанные на клеточной морфологии с использованием простой микроскопии на основе мобильного телефона, которая применима к недорогой оптической диагностике малярии в полевых условиях. 16].

Стратегия биозондирования в этом исследовании направлена ​​на обнаружение E . coli посредством индуцированного фагом лизиса в аутентичных образцах пищевых продуктов и искусственной воде для стирки с добавлением органических химикатов, имитирующих химическую потребность в кислороде (ХПК) воды для стирки. Фаги хорошо охарактеризованы как продуцирующие эндолизин, который может вызывать взрывной лизис клеток-хозяев [17]. Как показано на рис. 1, жизненный цикл литических фагов Т7 начинается, когда специализированные адсорбционные структуры, называемые хвостовыми волокнами Т7, связываются с молекулами рецептора на E . coli BL21 (шаг 1). Инъекция фаговой ДНК происходит, когда хвостовая трубка фага прокалывает мембранные слои E . coli с последующей инъекцией вирусного генома в цитоплазму клетки-хозяина (шаг 2) [18,19]. Сразу после введения генома фага Т7 происходит репликация генома фага; процесс, который включал кооптацию клеточного механизма хозяина. На этом этапе синтезируются многочисленные копии геномной ДНК фага (шаг 3).Затем белковые субъединицы фаговой частицы синтезируются и собираются в прокапсиды. На последнем этапе копия геномной ДНК фага упаковывается прокапсидом (этап 4). Затем зрелые фаги высвобождаются путем лизиса клетки-хозяина с помощью двух специфических ферментов, холина и лизина. Бактериальные клетки-хозяева, которые подвергаются индуцированному фагом лизису на рис. 1, иллюстрируют значительное изменение их клеточной морфологии, предложенное как переход «палочка-округлость» [20], за которым следует высвобождение внутриклеточной ДНК во внеклеточную, определяемую как экологическая ДНК (eDNA). .Изменения клеточной морфологии и высвобождение эДНК из бактерий-хозяев можно визуализировать под микроскопом в сочетании с простым окрашиванием ДНК и дальнейшим анализом флуоресцентного изображения с использованием BacFormatics v0.7, разработанного в MATLAB [20]. Ключевым преимуществом анализа флуоресцентных изображений является более высокое отношение сигнал/шум и повышенная чувствительность обнаружения, что гипотетически позволяет снизить предел обнаружения при низких концентрациях E . coli в различных пищевых матрицах.

Рис. 1.Жизненный цикл литических фагов Т7.

Этап 1, прикрепление фага Т7 к хозяину; шаг 2, инъекция фаговой ДНК бактериальному хозяину; шаг 3, метаболизм бактерий захвата фага и размножение ДНК фага; шаг 4, производство новых капсидов и сборка фагов; шаг 5, лизис клетки-хозяина и высвобождение кДНК.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233853.g001

Материалы и методы

Химические реактивы

SYBR Green I, краситель для нуклеиновых кислот, концентрат 10 000× был приобретен у Invitrogen, США, и был приготовлен рабочий раствор 10× SYBR Green I в воде Milli-Q. p -фенилендиамин и хлороформ получали от Acros Organic (Fair Lawn, NJ, USA) и готовили 10% (вес/объем) маточный раствор p -фенилендиамина в воде Milli-Q. Мембрана анодного неорганического фильтра Whatman® (13 мм, размер пор 0,02 мкм) была получена от GE Healthcare (Букингемшир, Великобритания). Предметное стекло получали от VWR international (Раднор, Пенсильвания, США). Триптический соевый бульон (TSB) и триптический соевый агар (TSA) были получены от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США).Система фильтрации, покровное стекло и бульон Luria Bertani (LB) были получены от Fisher Scientific (Питтсбург, Пенсильвания, США). Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) был приобретен у Fisher Bioregents (Fair Lawn, NJ, USA). Поликарбонатный фильтр (размер пор 20 мкм, диаметр 47 мм) был приобретен у компании Maine Manufacturing (Мэн, США). Воду Milli-Q получали с помощью системы очистки QPAK ® 2 (EMD Millipore, Billerica, MA, USA).

Бактериальные культуры и препараты фагов

Оба E . coli BL21 (ATCC BAA-1025) и бактериофаг T7 (ATCC BAA-1025-B2) были получены из американской коллекции типовых культур. Е . coli BL21 культивировали в бульоне TSB при 37°C в течение 16 часов перед использованием.

Бактериофаги размножали в соответствии со следующей процедурой. Бактериофаги сначала инокулировали в логарифмическую фазу E . coli BL21 в соотношении 1:100 (фаг:бактерии). Затем смесь инкубировали при 37°С в течение 15 мин для начальной инфекции, а затем центрифугировали при 16100× g в течение 10 мин.Супернатант удаляли и добавляли такой же объем TSB для ресуспендирования осадка с последующей инкубацией при 37°C при встряхивании со скоростью 200 об/мин до исчезновения видимой мутности. Затем добавляли хлороформ до конечной концентрации 20% (об./об.) и инкубировали при 4°С в течение ночи. Затем смесь с добавлением хлороформа центрифугировали при 5000 × g в течение 10 мин и собирали водную фазу. Водную фазу, которая содержала свободные фаги, среду TSB и остатки лизиса бактерий-хозяев, затем снова центрифугировали при 16100 × g в течение 10 мин.Осадок однократно промывали и ресуспендировали в PBS при концентрации фага 10 9 БОЕ/мл.

Фаг T7, индуцированный

E . coli лизис клеток

Фаг T7, индуцированный E . Лизис клеток coli проводили в двух режимах: лизис совместной инкубации с низким титром (LTCL) и двухэтапный лизис с высоким титром (HTTL). LTCL относится к совместной инкубации низкой исходной концентрации фага (10 2 БОЕ/мл) с E . coli в БСЭ.LTCL допускает начальный рост E . coli с замедленным лизисом. HTTL относится к обогащению E . coli сначала в TSB, а затем инокуляцию фага с высокой концентрацией титра (10 7 БОЕ/мл) для индуцирования лизиса в течение 20 мин.

Е . coli клеточные морфологические изменения и высвобождение эДНК во время LTCL

Динамическое морфологическое изменение E . coli и высвобождение кДНК анализировали с помощью LTCL в течение длительного периода лизиса, как сообщалось ранее [7,21].Короче, на ночь E . Культуры coli BL21 осаждали, промывали и ресуспендировали в PBS. Готовили 50-мл пробирку Falcon, содержащую 10 мл TSB, предварительно нагретую до 37°C, и инокулировали 10 3 КОЕ/мл E . coli BL21 и 10 2 БОЕ/мл Фаг T7. Засеянную пробирку затем инкубировали при 37°С во встряхивающем инкубаторе в течение 2, 3 и 4 часов, и в каждый момент времени отбирали 2 мл аликвоты соответственно. Затем аликвоты из каждой временной точки фильтровали через аноды и впоследствии окрашивали SYBR Green I.Процесс фильтрации и окрашивания проводили согласно опубликованному протоколу [22]. Вкратце, система фильтрации состояла из фильтрующей колбы, основания из фритированного стекла и поликарбонатного фильтра. Анодисковый фильтр располагался непосредственно над поликарбонатным фильтром, а стеклянная основа и фильтрующая колба были прикреплены под ним. Аликвоту из каждой пробирки осторожно пипеткой наносили на соответствующий анодный диск для фильтрации. После фильтрации анод осторожно удаляли с поликарбонатного фильтра на предметное стекло, на которое предварительно нанесли 20 мкл маточного раствора SYBR Green I.Затем анодный диск был перенесен непосредственно на каплю SYBR Green I тыльной стороной вниз, поскольку краситель может легко проходить через анодный диск и окрашивать микроорганизмы на его верхней стороне. Позже анод был окрашен в темном ящике лабораторного стола в течение 20 минут, прежде чем краситель был удален путем осторожного протирания заднего фильтра анода о Kimwipe. Тем временем 1% p -фенилендиамина был приготовлен из 10% исходного раствора в качестве реагента против выцветания. После окрашивания и удаления избытка красителей анодный диск переносили непосредственно на новое предметное стекло с каплей реагента против выцветания 20 мкл.В конечном итоге анод покрыли покровным стеклом и исследовали под инвертированным исследовательским флуоресцентным микроскопом Olympus IX-71 с объективом ×100 (1,25 NA), камерой CCD (устройство с зарядовой связью) (модель C4742-80-12AG, Hamamatsu, Токио, Япония) и ПО обработки изображений Metamorph (версия 7.7.2.0, Universal Imaging Corporation). Для каждого образца анодного диска было сделано в среднем 10–12 изображений. Длина волны возбуждения/испускания флуоресценции красителя SYBR Green I составляла 480 ± 30 и 535 ± 40 нм соответственно.Отрицательные контроли выполняли в тех же условиях, за исключением добавления фагов. Все условия, включая отрицательный контроль, были выполнены в трех повторностях.

Характеристика

E . coli морфологическое изменение и высвобождение эДНК через LTCL

Была проведена аналогичная экспериментальная процедура, описанная в предыдущем разделе. Готовили три пробирки Falcon объемом 50 мл (A, B и C), содержащие 10 мл TSB, и в каждую пробирку инокулировали 10 2 БОЕ/мл фагов T7.Трубка А получила E . Посев coli в количестве 10 2 КОЕ/мл, пробирка B получила E . Инокуляция coli в концентрации 10 3 КОЕ/мл, в то время как в пробирку C вводили E . Посев coli при 10 4 КОЕ/мл. Затем все пробирки инкубировали при 37°С при встряхивании со скоростью 200 об/мин в течение 2, 3 и 4 часов соответственно. После инкубации содержимое каждой пробирки фильтровали на соответствующий анодный диск, затем окрашивали и исследовали под флуоресцентным микроскопом, как описано ранее.Отрицательный контроль проводили в тех же условиях без инокуляции фагом. И группы с добавлением фага, и отрицательные контроли были выполнены в трех повторностях.

Характеристика

E . Морфологическое изменение coli и высвобождение эДНК через HTTL

Для начала были подготовлены три 50-мл пробирки Falcon (A, B и C), каждая из которых содержала 5 мл TSB, и предварительно нагреты в водяной бане при 37°C перед инокуляцией. Ночевка E . Культуры coli BL21 осаждали, промывали и ресуспендировали в PBS с последующим посевом в пробирки A, B и C при 10 1 , 10 2 и 10 3 КОЕ/мл соответственно.Затем все пробирки инкубировали при 37°С при встряхивании со скоростью 200 об/мин в течение 5, 4 и 2 часов соответственно. После инкубации фаги Т7 инокулировали во все пробирки в концентрации 10 7 БОЕ/мл с последующим лизисом в тех же условиях в течение 20 мин. Затем аликвоты из каждой пробирки фильтровали через аноды, затем окрашивали SYBR Green и исследовали под микроскопом, как описано ранее. Отрицательный контроль проводили в тех же условиях без добавления фага. Все условия, включая отрицательный контроль, были выполнены в трех повторностях.

Валидация биосенсорного подхода к реалистичным продуктам питания

HTTL был выбран как более надежный, последовательный и чувствительный подход для анализа морфологических изменений и высвобождения эДНК E . coli в реалистичных пищевых матрицах, включая искусственную воду для мытья, кокосовую воду и воду для мытья шпината. Кокосовая вода была выбрана в качестве сложной матрицы, поскольку она содержит сахара, аминокислоты, витамины и фитогормоны [23]. Искусственная вода для промывки была создана путем добавления бульона LB в стерильную воду для достижения конечного ХПК на уровне 1000 частей на миллион, что сравнимо с водой для промывки свежесрезанных продуктов в промышленности [24].Как кокосовая вода, так и искусственная промывочная вода были инокулированы E . coli в концентрации 10 КОЕ/мл с последующим смешиванием с TSB двойной концентрации в соотношении 1:1 (об./об.) для предварительного обогащения. Смесь затем встряхивали, инкубировали при 37°C в течение 5 часов и затем лизировали с помощью 10 7 БОЕ/мл фагов Т7 в течение 20 минут. Содержимое после лизиса фильтровали на анод, окрашивали и визуализировали под микроскопом. Также был проведен отрицательный контроль без фагового лизиса, и оба условия были выполнены в трех повторностях.Для воды для промывания шпината подробная подготовка проб описана в дополнительной информации.

Анализ изображения — предварительная обработка

Все изображения были подвергнуты анализу с помощью программного обеспечения Matlab TM 2017a (Mathworks, Natick, Mass., USA) для создания бинарных изображений с последующей количественной оценкой морфологических признаков. Перед преобразованием бинарных изображений был применен ряд функций предварительной обработки изображения для улучшения визуального восприятия изображения, устранения неравномерного фонового освещения и корректировки колебаний при сборе данных.В частности, для наилучшего представления внешнего вида изображений была применена функция шагов для создания дискообразного структурирующего элемента радиусом 30 пикселей [25]. Затем применялась функция imtophat для удаления неравномерной фоновой засветки изображения с темным фоном [26]. Затем изображения обрабатывались медианной фильтрацией (функция medfilt2 ) в двух измерениях: каждый выходной пиксель равен среднему значению медианы в 3 × 3 смежных соответствующих пикселях входного изображения.Применяя медианную фильтрацию, можно устранить колебания сигнала в процессе сбора данных без ущерба для резкости изображения [27]. Затем для повышения контрастности изображений в градациях серого была использована функция adapthisteq для настройки изображений с последующим сглаживанием изображений с использованием низкочастотного фильтра Винера. Фильтр Винера удаляет постоянный аддитивный шум (гауссовский белый шум), чтобы сохранить края или другие высокочастотные части изображения [27].

Анализ изображений – сегментация изображений и количественная оценка морфологических признаков

Общая цель сегментации изображения состояла в том, чтобы определить границы каждого E . coli и измеряют изменения площади и формы клеток. Затем сегментированные изображения были преобразованы в бинарные изображения на основе глобального порога. Бинаризация изображений была ключевым шагом к количественной интерпретации данных изображений с помощью компьютерного машинного зрения, а не человеческого зрения. Чтобы быть более конкретным, функция Graythresh была применена для создания глобального порога. Функция Graythresh была основана на методе Оцу, который минимизирует внутриклассовую дисперсию между черными и белыми пикселями [28].Затем бинарные изображения были созданы на основе порога, сгенерированного из функции greythresh . В принципе, любая точка (x, y) на входном изображении, которая имеет функцию f (x, y) ≥T, будет обозначаться как белый пиксель (объект), в то время как другая точка, которая имеет f (x, y) < T будет использоваться как черный пиксель (фон). Генерация бинарного изображения создавалась функцией imbinarize [27]. Для дальнейшего упрощения процесса анализа изображения была применена функция imfill для заполнения пробелов во входном бинарном изображении.Отверстия определяются как фоновые пиксели (черные), окруженные пикселями объекта (белыми) [27]. В некоторых случаях некоторые мелкие частицы могут иметь вид SYBR green I, который может иногда неспецифически окрашиваться на аноде. Затем была применена функция bwareaopen для удаления любых частиц размером менее 300 пикселей [29].

После того, как бинарные изображения были созданы, изменены и очищены, была проведена количественная оценка морфологических признаков с использованием функции regionprops .Бактерии, не подвергшиеся индуцированному фагом лизису, имеют палочковидную форму с ограниченным участком ДНК. Для сравнения, бактерии, которые подверглись лизису фага, имели круглую форму с диффузным распределением высвобожденной эДНК, окрашенной SYBR Green I. Для статистического и объективного сравнения изменения клеточной морфологии и высвобождения эДНК «площадь» и «эксцентриситет» были выбраны как два значения. параметры, представляющие относительное изменение клеточной морфологии. Свойство «площадь» относится к фактическому количеству пикселей в области объекта, которое может быть связано с высвобождением эДНК (большая площадь, больше высвобождение эДНК), а свойство «эксцентриситет» относится к форме эллипса и измеряет расстояние. отношение между фокусами эллипса и длиной его большой оси.Значение отношения «эксцентриситет» находится в диапазоне от 0 до 1, где 0 относится к окружности, а 1 относится к отрезку линии. Параметр «эксцентриситет» связан с формой бактерий, где палочковидные бактерии имеют эксцентриситет ближе к 1, а лизированные круглые бактерии имеют эксцентриситет ближе к 0,

Распределение интенсивности флуоресценции было еще одним морфологическим свойством, выбранным для обнаружения изменения клеточной формы из-за высвобождения внутренней ДНК, которое было представлено полной шириной на половине максимума (FWHM) кривой распределения интенсивности.Для анализа изображений все флуоресцентные изображения были проанализированы с помощью ImageJ. Плагин FWHM_Line использовался для создания двумерного графика интенсивностей пикселей вдоль 100-пиксельной линии, проведенной через поперечное сечение отдельных ячеек. Данные распределения интенсивности были приспособлены к распределению Гаусса, и была измерена полная ширина на половине максимума.

Статистический анализ

Все состояния, которые подвергались анализу площади, эксцентриситета и распределения интенсивности, были проведены в трех экземплярах, и из каждого повтора для анализа было выбрано 5–8 изображений в каждом повторе.Всего было проанализировано 15–20 изображений, содержащих общее количество объектов, равное или превышающее 100 (N ≥100). Площадь, эксцентриситет и значение FWHM были получены из каждого изображения и усреднены. Среднее значение площади, эксцентриситета и FWHM статистически сравнивали между изображениями, лизированными фагом, и их соответствующими отрицательными контролями, используя SAS 9.4 (SAS Institute Inc., Кэри, Северная Каролина) с помощью теста честной значимой разницы Тьюки (HSD) для сравнения средних значений.

Результаты

Е . coli клеточные морфологические изменения и высвобождение эДНК во время LTCL

Общая цель этой серии экспериментов заключалась в разработке основанной на визуализации структуры для характеристики изменений в клеточной морфологии и высвобождения эДНК после лизиса E . Клетки coli с фагами в условиях инкубации LTCL. Как показано на фиг. 2, начальная концентрация фага составляла 10 2 БОЕ/мл и Е . coli BL21 составляла 10 3 КОЕ/мл в TSB.Фаг- Е . Затем смесь coli инкубировали в течение 2 и 3 часов при 37°C и получали изображения, как показано на фиг. 2A и 2C соответственно. Для сравнения, отрицательный контроль без добавления фагов также проводили в тех же условиях, как показано на фиг. 2B и 2D соответственно. Как показано на фиг. 2А и 2В, совместная инкубация фага и бактерии в течение 2 часов действительно приводила к наблюдаемому изменению морфологии клеток или высвобождению эДНК. Через 3 часа наблюдался лизис клеток, как показано на рис. 2С, с переходом от клеток палочковидной формы к клеткам округлой формы.Высвобождение эДНК, как видно на рис. 2C, также было заметным; в виде увеличенных клеточных областей флуоресцентного сигнала с нечеткой границей, что увеличивает распределение интенсивности клеточных частиц. Ни морфологические изменения клеток, ни появление какого-либо сигнала эДНК не были очевидны для отрицательного контроля (рис. 2D).

Рис. 2. Изменение морфологии бактерий во время индуцированного фагом лизиса при совместной инкубации E . coli и фаги Т7 в течение 2 и 3 часов.

а) морфология клеток при совместной инкубации E . coli и фаги Т7 в течение 2 часов. б) морфология клеток при инкубации всего E . coli на 2 часа. в) морфология клеток при совместной инкубации E . coli и фаги Т7 в течение 3 часов. г) морфология клеток при инкубации всего E . coli на 3 часа.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233853.g002

Предел обнаружения

E . coli на основе морфологических изменений и высвобождения эДНК через LTCL

В этом подходе E . coli совместно инкубировали с низким титром фага, чтобы обеспечить начальное размножение бактерий с последующим лизисом фага. Площадь, эксцентриситет и параметр FWHM, взятые вместе, были оценены, чтобы отличить «нетронутые» E . coli клетки из E . coli , которые «лизируются фагами». Как показано на рис. 3, E . coli при 10 3 КОЕ/мл можно обнаружить на основе изменений в выбранных морфологических частицах после инкубации с 10 2 БОЕ/мл фагов Т7.Фиг.3А и 3В иллюстрируют микроскопическое изображение и бинарное изображение отрицательного контроля (только E . coli инкубировали в течение 3 часов). Для сравнения, рис. 3C и 3D иллюстрируют микроскопическое изображение и бинарное изображение E . Фаг coli -T7 для условий инкубации LTCL. На основе методов анализа изображения, описанных в предыдущем разделе, значения площади и эксцентриситета для E . coli , лизированные фагами Т7, демонстрируют значительные отличия по сравнению с контролем (P < 0.05). В общем, E . coli , лизированные фагами Т7, выявили значительное высвобождение эДНК и изменение морфологии от стержневой до кольцевой.

Рис. 3. Обнаружение 10 3 КОЕ/мл E . coli через LTCL с 10 2 БОЕ/мл фага Т7.

а) отрицательный контроль, содержащий только E . coli растет в течение 3 часов. б) бинарное изображение а). в) индуцированный фагом лизис при совместной инкубации с E . кишечная палочка .г) бинарное изображение в). e) сравнение значений площади, извлеченных из b) и d). f) сравнение значений эксцентриситета, извлеченных из b) и d). ж) сравнение полной ширины на половине максимума, извлеченной из а) и с). *указана значимая разница (P <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233853.g003

Обнаружение E . coli при начальной концентрации 10 2 и 10 4 КОЕ/мл также проводили аналогичным образом с использованием условий инкубации LTCL.Полученные изображения были показаны, проанализированы и сравнены на рисунках S1 и S2 соответственно. Как показано на рис. S1, существенной разницы (P > 0,05) не наблюдалось для всех параметров (площадь, эксцентриситет и полуширина) между изображениями из выборок E . coli инкубировали с фагом Т7 и отрицательным контролем, что указывает на E . coli при исходной концентрации 10 2 КОЕ/мл невозможно обнаружить с использованием условий инкубации LTCL и анализа изображений из-за отсутствия значительного лизиса клеток.Для сравнения, E . coli при начальной концентрации 10 4 КОЕ/мл можно обнаружить с помощью LTCL, анализа изображений и сравнения параметров площади, эксцентриситета и FWHM (S2 Fig).

Характеристика

E . Морфологическое изменение coli и высвобождение эДНК через HTTL

Е . coli при 10 КОЕ/мл можно обнаружить с помощью HTTL, как показано на фиг. 4. На фиг. 4А и 4В показано микроскопическое изображение и бинарная картина отрицательного контроля, где Е . coli инкубировали в течение 5 часов. Для сравнения, на рис. 4C и 4D представлены микроскопическое изображение и бинарное изображение E . coli , лизированный фагом Т7 посредством HTTL. Сравнение количественного анализа изображений между рис. 4B и 4D представлено на рис. 4E–4G. Чтобы быть конкретным, разница в площади сравнивалась и суммировалась на фиг. 4E, где E . Клетки coli , лизированные фагом Т7, демонстрировали большую площадь окрашивания из-за утечки ДНК. Изменения формы также наблюдались на рис. 4F, где E имеет более округлую морфологию. coli были получены после лизиса, индуцированного фагом Т7. Кроме того, интенсивность рассеянного флуоресцентного сигнала от фага Т7 лизировала E . Клетки coli наблюдались на фиг. 4G на основе количественного определения параметров FWHM по сравнению с контролем. Таким образом, все параметры площади, эксцентриситета и FWHM указывают на статистическую разницу между HTTL и отрицательным контролем (P <0,05), что указывает на E . coli при исходной концентрации 10 КОЕ/мл можно обнаружить с помощью HTTL и анализа изображений.

Рис. 4. Обнаружение 10 КОЕ/мл E . coli путем обогащения и HTTL.

а) отрицательный контроль, содержащий только E . coli растет в течение 5 часов. б) бинарное изображение а). в) индуцированный фагом лизис после E . coli обогащение. г) бинарное изображение в). e) сравнение значений площади, извлеченных из b) и d). f) сравнение значений эксцентриситета, извлеченных из b) и d). ж) сравнение полной ширины на половине максимума, извлеченной из а) и с).*указана значимая разница (P <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233853.g004

Обнаружение E . coli при исходной концентрации 10 2 и 10 3 КОЕ/мл также были получены с помощью HTTL, анализа изображения и сравнения площади, эксцентриситета и полуширины на полувысоте представлены на рис. S3 и S4 соответственно.

Обнаружение

E . coli при 10 КОЕ/мл в искусственной промывной воде и кокосовой воде

HTTL был выбран в качестве предпочтительного метода лизиса для быстрого обнаружения E . coli в реальных образцах пищевых продуктов, поскольку HTTL демонстрирует более низкий предел обнаружения (10 КОЕ/мл) по сравнению с LTCL (10 3 КОЕ/мл), как описано ранее, исходя из параметров площади, эксцентриситета и полуширины.

Как показано на рис. 5, E . coli с концентрацией 10 КОЕ/мл можно обнаружить с помощью HTTL в сочетании с получением и анализом изображений. На фиг. 5А и 5В показано микроскопическое изображение и бинарная картина отрицательного контроля, где Е . coli обогащали в искусственной промывной воде-ТСБ в течение 5 часов.Для сравнения, на рис. 5C и 5D представлены микроскопическое изображение и бинарное изображение E . coli , лизированный фагом Т7 через HTTL после обогащения. Параметры площади, эксцентриситета и полуширины были извлечены и статистически сравнены на рис. 5E, 5F и 5G. Как упоминалось в предыдущем разделе, большая площадь окрашивания, меньший эксцентриситет (более круговая морфология) и большие значения FWHM (диффузный флуоресцентный сигнал) указывали на лизис E . Клетки coli при инкубации с фагами Т7.Таким образом, на основании значительных различий в параметрах количественного анализа изображений результаты показали E . coli с концентрацией 10 КОЕ/мл можно обнаружить с помощью HTTL и анализа изображений в имитированных образцах промывочной воды.

Рис. 5. Обнаружение 10 КОЕ/мл E . coli путем обогащения и HTTL в искусственной промывной воде.

а) отрицательный контроль, содержащий только E . coli растет в течение 5 часов. б) бинарное изображение а).в) индуцированный фагом лизис после E . coli обогащение. г) бинарное изображение в). e) сравнение значений площади, извлеченных из b) и d). f) сравнение значений эксцентриситета, извлеченных из b) и d). ж) сравнение полной ширины на половине максимума, извлеченной из а) и с). *указана значимая разница (P <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233853.g005

Аналогичные эксперименты были проведены с кокосовой водой, и полученные изображения, бинарные изображения и анализ параметров показаны на рис. 6. Е . coli с концентрацией 10 КОЕ/мл можно обнаружить с помощью HTTL и анализа изображения в кокосовой воде. Предложенный новый метод обнаружения также проверен в воде для промывки шпината, подробный анализ данных и результаты включены в вспомогательную информацию.

Рис. 6. Обнаружение 10 КОЕ/мл E . coli путем обогащения и HTTL в кокосовой воде.

а) отрицательный контроль, содержащий только E . coli растет в течение 5 часов.б) бинарное изображение а). в) индуцированный фагом лизис после E . coli обогащение. г) бинарное изображение в). e) сравнение значений площади, извлеченных из b) и d). f) сравнение значений эксцентриситета, извлеченных из b) и d). ж) сравнение полной ширины на половине максимума, извлеченной из а) и с). *указана значимая разница (P <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233853.g006

Обсуждение

Исследование иллюстрирует простую, быструю и экономичную стратегию биозондирования для обнаружения E . coli в имитированной воде для мытья, кокосовой воде и воде для мытья шпината. Эта концепция потенциально может быть расширена для обнаружения других бактерий, представляющих интерес для безопасности пищевых продуктов, с использованием литических фагов, специфичных для хозяина. Принцип предлагаемой стратегии биозондирования довольно прост: он фокусируется на морфологических изменениях клеток-хозяев и высвобождении эДНК при лизисе клеток-хозяев. Насколько нам известно, это первое исследование, в котором описывается сочетание морфологических изменений, высвобождения эДНК и анализа изображений для достижения быстрого обнаружения E . coli в реалистичных пищевых матрицах. Применение визуализации и анализа изображений в качестве подхода к обнаружению также применялось в BARDOT — быстром обнаружении бактерий с использованием технологии оптического рассеяния. В методе БАРДО лазерный луч обычно проходит через бактериальную колонию для анализа трехмерных морфологических и оптических характеристик для создания оптического «отпечатка пальца». Предлагаемая нами стратегия биозондирования с использованием аналогичного подхода к оптической визуализации и анализу изображений обеспечивает значительно более быстрое обнаружение по сравнению с анализами формирования колоний, используемыми для BARDOT.Например, для получения обнаруживаемых колоний Bacillus и Listeria требовалось не менее 6–8 часов или 24–36 часов соответственно [30–32]. Для сравнения, скорость предлагаемой нами стратегии биозондирования указана в таблице 1, и, как показано в таблице 1, общее время для этой предлагаемой стратегии биосенсора составляет менее 8 часов. Это временные рамки, которые укладываются в типичную производственную смену упаковки скоропортящихся продуктов. Можно утверждать, что этот подход не устранил первоначальный процесс обогащения, поскольку он значительно увеличивает время всей процедуры, но использование текущего подхода к анализу изображений было невозможно без ущерба для предела обнаружения.Несколько других методов быстрого обнаружения, основанных на ПЦР, фаговом и иммуноанализе, по-прежнему используют обогащение в качестве этапа предварительного обнаружения для повышения эффективности методов [14,33–37]. Есть еще одна приемлемая причина для рассмотрения возможности обогащения. Было отмечено, что бактериальные клетки, которые естественным образом находятся в пище/окружающей среде, проявляют поврежденный фенотип из-за различных стрессов, что может снизить чувствительность бактерий к фагам как на этапе заражения, так и на стадии размножения. Стадия обогащения может реанимировать поврежденные клетки, тем самым сделав их восприимчивыми к фаговой инфекции и, следовательно, обнаруживаемыми предлагаемым методом.

Таблица 1. Анализ общего времени и затрат на жидкую пищевую матрицу (25 мл) с использованием предложенной стратегии биосенсорного обнаружения E . кишечная палочка .

Все цены указаны у поставщиков, перечисленных в разделе «Материалы и методы».

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233853.t001

Стратегия биозондирования, разработанная в этом исследовании, также экономически эффективна. В таблице 1 приведена стоимость метода обнаружения, которая составляет около 5 долларов.50 за образец. Основные расходы на стратегию биосенсора составляют аноды (4,40 долл. США), которые потенциально могут быть заменены другим более дешевым материалом, обеспечивающим аналогичные характеристики с низким фоном флуоресценции при окрашивании SYBR Green I.

Некоторые из потенциальных проблем при переносе результатов этого исследования в полевые приложения могут включать: точный контроль активности фагов и присутствие других бактерий с кольцевой морфологией в пищевой матрице. Основываясь на наших наблюдениях, активность фага необходимо точно контролировать для обеспечения своевременного обнаружения, поскольку более старая партия фага из-за сниженного титра фага или более слабой инфекционной активности может занять больше времени для лизиса.Чтобы частично устранить несоответствие активности фагов, каждые две недели готовили новую партию фагов. Еще одним потенциальным ограничением стратегии биосенсора является фоновая микрофлора. Присутствие кокковых бактерий, таких как Staphylococcus spp., может повлиять на значение эксцентриситета во время анализа изображения. Наличие бактерий, значительно превышающих E . coli , например, некоторые виды Pseudomonas , также могут влиять на расчет площади.Потенциальная проблема фоновой микрофлоры была частично решена в рукописи путем одновременного исследования изменений как площади, так и параметров эксцентриситета, а также проверки в реалистичных образцах воды для промывки шпината, чтобы сделать вывод о наличии/отсутствии E . кишечная палочка . «Распределение интенсивности», которое представляет собой интенсивность флуоресценции в зависимости от расстояния линии, проходящей через центр тяжести бактериальной клетки, является еще одним параметром, который позволяет обнаружить лизис бактериальной клетки.Лизис клеточной мембраны приводит к диффузному распределению ДНК. Это диффузное распределение увеличивает ширину на половине максимума, в то время как нелизированные клетки демонстрируют сфокусированное окрашивание ДНК и уменьшают полную ширину на половине максимума.

В рукописи также описаны два режима лизиса, LTCL и HTTL. Оба пути лизиса имеют преимущества и недостатки. LTCL обеспечивает более легкую подготовку образцов как фаги и E . coli совместно инкубировали без дополнительной стадии перед фильтрацией.Этот способ подготовки образцов для обнаружения целевых бактерий с использованием фагов также был задокументирован в нескольких исследованиях [7,21]. Однако были отмечены основные недостатки LTCL, такие как предел относительной нечувствительности обнаружения на уровне 10 3 КОЕ/мл. Для сравнения, HTTL обеспечивает лучший предел обнаружения в нашем текущем исследовании на уровне 10 КОЕ/мл, даже несмотря на то, что подготовка образца требует как обогащения, так и добавления фага на двух разных этапах. В заключение, режим лизиса HTTL является лучшим подходом в нашей стратегии биозондирования.

Заключение

В заключение, это исследование демонстрирует простую, быструю и экономически эффективную стратегию биосенсорного анализа, которая направлена ​​на изменение морфологии клеток-хозяев и высвобождение эДНК с последующим автоматическим получением изображений и анализом. Предлагаемый метод был протестирован для быстрого обнаружения E . coli при 10 КОЕ/мл в течение 8 часов всего процесса. Этот метод также был проверен на трех различных реалистичных матрицах — искусственной воде для мытья свежих продуктов, кокосовой воде и воде для мытья шпината.Будущие исследования могут быть проведены для включения разнообразной фоновой микрофлоры и для проверки надежности предлагаемой стратегии биосенсорного анализа на большем количестве пищевых матриц.

Дополнительная информация

S1 Рис. Обнаружение 10

2 КОЕ/мл E . coli через LTCL с 10 2 БОЕ/мл фага T7 в течение 4 часов.

а) отрицательный контроль, содержащий только E . coli растет в течение 4 часов. б) бинарное изображение а).в) индуцированный фагом лизис при совместной инкубации с E . кишечная палочка . г) бинарное изображение в). e) сравнение значений площади, извлеченных из b) и d). f) сравнение значений эксцентриситета, извлеченных из b) и d). ж) сравнение полной ширины на половине максимума, извлеченной из а) и с).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233853.s001

(DOCX)

S2 Рис. Обнаружение 10

4 КОЕ/мл E . coli через LTCL с 10 2 БОЕ/мл фага T7 в течение 2 часов.

а) отрицательный контроль, содержащий только E . coli выращивают в течение 2 часов. б) бинарное изображение а). в) индуцированный фагом лизис при совместной инкубации с E . кишечная палочка . г) бинарное изображение в). e) сравнение значений площади, извлеченных из b) и d). f) сравнение значений эксцентриситета, извлеченных из b) и d). ж) сравнение полной ширины на половине максимума, извлеченной из а) и с). *указана значимая разница (P <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233853.s002

(DOCX)

S3 Рис. Обнаружение 10

2 КОЕ/мл E . coli через 4 часа обогащения и HTTL.

а) отрицательный контроль, содержащий только E . coli растет в течение 4 часов. б) бинарное изображение а). в) индуцированный фагом лизис после E . coli обогащение. г) бинарное изображение в). e) сравнение значений площади, извлеченных из b) и d). f) сравнение значений эксцентриситета, извлеченных из b) и d).ж) сравнение полной ширины на половине максимума, извлеченной из а) и с). *указана значимая разница (P <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233853.s003

(DOCX)

S4 Рис. Обнаружение 10

3 КОЕ/мл E . coli через 2 часа обогащения и HTTL.

а) отрицательный контроль, содержащий только E . coli растет в течение 2 часов а) отрицательный контроль, который содержит только E . coli выращивают в течение 2 часов. б) бинарное изображение а). в) индуцированный фагом лизис после E . coli обогащение. г) бинарное изображение в). e) сравнение значений площади, извлеченных из b) и d). f) сравнение значений эксцентриситета, извлеченных из b) и d). ж) сравнение полной ширины на половине максимума, извлеченной из а) и с). *указана значимая разница (P <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233853.s004

(DOCX)

S5 Рис.Обнаружение 10

3 КОЕ/мл E . coli через 3 часа обогащения и HTTL в воде для промывки шпината.

а) отрицательное контрольное изображение, содержащее только E . coli растет в течение 3 часов. б) индуцированный фагом лизис после E . coli обогащение. c) сравнение площади, d) сравнение эксцентриситета и e) сравнение полной ширины при полумаксимальных значениях между E . Клетки coli с лизисом, индуцированным Т7, или без него.*указана значимая разница (P <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233853.s005

(DOCX)

S6 Рис. Флуоресцентные изображения различных не-

E . coli бактериальных клеток с инфекцией фагом Т7 и без нее.

а) Bacillus subtilis без инфекции, б) Bacillus subtilis с инфекцией, в) Lactobacillus casei без инфекции, г) Lactobacillus casei с инфекцией, д) Listeria innocua

) без инфекции, Listeria innocua с инфекцией, g) Pseudomonas fluorescens без инфекции и h) Pseudomonas fluorescens с инфекцией.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233853.s006

(DOCX)

Каталожные номера

  1. 1. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов. Окончательное заявление о воздействии на окружающую среду (EIS) для предлагаемого правила: стандарты выращивания, сбора урожая, упаковки и хранения продуктов для потребления человеком. Администрация пищевых продуктов и лекарств, 2015 г.
  2. 2. NRDC. Впустую: как Америка теряет до 40 процентов своей еды от фермы до вилки и на свалку — второе издание. Папка выпуска NRDC. 2017; 1–58. doi: 12-06-B
  3. 3.EPA/US EPA (Агентство по охране окружающей среды США). Метод 7473. Ртуть в твердых телах и растворах методами термического разложения, амальгамации и атомно-абсорбционной спектрометрии. SW-846, Методы испытаний Оценка твердых отходов, Физические методы. 2007.
  4. 4. Bergh Ø, Børsheim KY, Bratbak G, Heldal M. Большое количество вирусов, обнаруженных в водной среде. Природа. 1989. пмид:2755508
  5. 5. Бровко Л.Я., Анани Х., Гриффитс М.В. Бактериофаги для обнаружения и контроля бактериальных патогенов в пищевых продуктах и ​​пищевой среде.Достижения в области исследований пищевых продуктов и питания. 2012. pmid:23034118
  6. 6. Баггесен Д.Л., Соренсен Г., Нильсен Э.М., Вегенер Х.К. Фаговое типирование Salmonella Typhimurium — по-прежнему ли это полезный инструмент для эпиднадзора и расследования вспышек? Евронаблюдение. 2010.
  7. 7. Анани Х., Бровко Л., Эль Дугдуг Н.К., Сохар Дж., Фенн Х., Аласири Н. и др. Распечатайте для обнаружения: быстрый и сверхчувствительный тест-полоски на основе фагов для выявления патогенов пищевого происхождения. Анальный биоанальный хим.2018. pmid:28940009
  8. 8. Приход М.Э., Гудрич Р.М. Восстановление предполагаемых штаммов Alicyclobacillus с поверхности плодов апельсина. J Пищевая защита. 2005; 68: 2196–2200. Доступно: http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.0-26644460420&partnerID=40&md5=55c142840f2b5e9cb54333c1c8fd1d0c pmid:16245729
  9. 9. Гермес КП, Саттл, Калифорния. Прямой подсчет вирусов в природных водах и лабораторных культурах методом эпифлуоресцентной микроскопии. Лимнол океаногр. 1995.
  10. 10. Lee SH, Onuki M, Satoh H, Mino T. Выделение, характеристика бактериофагов, специфичных к Microlunatus phovorus , и их применение для быстрого обнаружения хозяина. Lett Appl Microbiol. 2006. pmid:16478514
  11. 11. Эдгар Р., МакКинстри М., Хван Дж., Оппенгейм А.Б., Фекете Р.А., Джулиан Г. и др. Высокочувствительное обнаружение бактерий с использованием меченых биотином фагов и нанокомплексов с квантовыми точками. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006. pmid:16549760
  12. 12.Джексон А.А., Хинкли Т.К., Талберт Дж.Н., Нуген С.Р., Села Д.А. Генетическая оптимизация доставляемого бактериофагом репортера щелочной фосфатазы для обнаружения: Escherichia coli . Аналитик. 2016. pmid:27412402
  13. 13. Чен Дж., Алкаин С.Д., Джексон А.А., Ротелло В.М., Нуген С.Р. Разработка инженерных бактериофагов для обнаружения Escherichia coli и высокопроизводительного определения устойчивости к антибиотикам. Датчики СКУД. 2017. пмид:28723178
  14. 14. Wisutiphaet N, Yang X, Young GM, Nitin N.Быстрое обнаружение Escherichia coli в напитках с использованием генно-инженерного бактериофага Т7. АМБ Экспресс. 2019. пмид:31004244
  15. 15. Кортези М., Бандиера Л., Пасини А., Бевилаква А., Герарди А., Фурини С. и др. Надежное измерение распределения флуоресценции отдельных клеток E. coli с использованием стандартной установки микроскопа. J Biol Eng. 2017. pmid:28239411
  16. 16. Агбана Т.Е., Дил Дж.К., Ван Пул Ф., Хан С.М., Патлан ​​В., Верхэген М. и др.Визуализация и идентификация малярийных паразитов с помощью микроскопа мобильного телефона с шаровой линзой. ПЛОС Один. 2018. пмид:30286150
  17. 17. Лесснер М.Дж. Эндолизины бактериофагов. Текущее состояние исследований и приложений. Текущее мнение в микробиологии. 2005. pmid:15979390
  18. 18. Костюченко В.А., Чипман П.Р., Лейман П.Г., Арисака Ф., Месянжинов В.В., Россманн М.Г. Структура хвоста бактериофага Т4 и механизм его сокращения. Nat Struct Mol Biol. 2005.пмид:16116440
  19. 19. Костюченко В.А., Лейман П.Г., Чипман П.Р., Канамару С., Ван Раай М.Дж., Арисака Ф. и др. Трехмерная структура базальной пластинки бактериофага Т4. Nat Struct Biol. 2003. пмид:12923574
  20. 20. Тернбулл Л., Тойофуку М., Хайнен А.Л., Куросава М., Песси Г., Петти Н.К. и др. Взрывной лизис клеток как механизм биогенеза бактериальных мембранных везикул и биопленок. Нац коммун. 2016. pmid:27075392
  21. 21. Тилтон Л., Дас Г., Ян Х, Висутифает Н., Кеннеди И.М., Нитин Н.Нанофотонное устройство в сочетании с бактериофагами для повышения чувствительности обнаружения Escherichia coli в моделируемой промывной воде. Анальный латыш. 2019.
  22. 22. Патель А., Ноубл Р.Т., Стил Дж.А., Швальбах М.С., Хьюсон И., Фурман Дж.А. Подсчет вирусов и прокариот из планктонной водной среды с помощью эпифлуоресцентной микроскопии с SYBR Green I. Nat Protoc. 2007. pmid:17406585
  23. 23. Yong JWH, Ge L, Ng YF, Tan SN. Химический состав и биологические свойства кокоса (Cocos Nucifera L.) вода. Молекулы. 2009. pmid:20032881
  24. 24. Элизакивель П., Санчес Г., Сельма М. В., Аснар Р. Применение моноазида пропидия-КПЦР для оценки ультразвуковой инактивации Escherichia coli O157: H7 в воде для мытья свежесрезанных овощей. Пищевой микробиол. 2012. пмид:22265318
  25. 25. Блахута Дж., Соукуп Т., Чермак П. Обработка изображений медицинских диагностических нейросонографических изображений в MATLAB. Недавние исследования в области компьютерных наук — материалы 15-й Международной конференции WSEAS по компьютерам, часть 15-й мультиконференции WSEAS CSCC.2011.
  26. 26. Равиндран ПБ. Исследование теста Уинстона-Лутца на двух разных электронных портальных устройствах визуализации и с визуализацией с низким энергопотреблением. Australas Phys Eng Sci Med. 2016. pmid:27435984
  27. 27. Алтан А., Маккарти К.Л., Тикекар Р., Маккарти М.Дж., Нитин Н. Анализ изображений микроструктурных изменений семядолей миндаля в результате обработки. Дж. Пищевая наука. 2011. pmid:21535761
  28. 28. Оцу Н. Метод порогового выбора из гистограмм серого.IEEE Trans Syst Man Cybern. 1979.
  29. 29. Нандури Дж. Р., Пино-Роменвиль Ф. А., Селик И. Создание сетки CFD для биологических потоков: реконструкция геометрии с использованием диагностических изображений. Компьютерные жидкости. 2009.
  30. 30. Banada PP, Guo S, Bayraktar B, Bae E, Rajwa B, Robinson JP и др. Оптическое прямое рассеяние для обнаружения Listeria monocytogenes и других видов Listeria. Биосенс ​​Биоэлектрон. 2007. pmid:16949268
  31. 31. Ким Х, Сингх А.К., Бхуния А.К., Бэ Э.Лазерно-индуцированные картины рассеяния спеклов в колониях Bacillus . Фронт микробиол. 2014. pmid:25352840
  32. 32. Bae E, Banada PP, Huff K, Bhunia AK, Robinson JP, Hirleman ED. Биофизическое моделирование прямого рассеяния от бактериальных колоний с использованием скалярной теории дифракции. Прил. опт. 2007. pmid:17514326
  33. 33. Mukhopadhyay A K. Mukhopadhyay U. Новые подходы мультиплексной ПЦР для одновременного обнаружения патогенов человека: Escherichia coli O157:H7 и Listeria monocytogenes .J Микробиологические методы. 2007. pmid:16963139
  34. 34. Sharp NJ, Vandamm JP, Molineux IJ, Schofield DA. Быстрое обнаружение Bacillus anthracis в сложных пищевых матрицах с использованием биолюминесценции, опосредованной фагами. J Пищевая защита. 2015. пмид:25951391
  35. 35. Chen S, Wang F, Beaulieu JC, Stein RE, Ge B. Быстрое обнаружение жизнеспособных сальмонелл в продуктах путем сочетания моноазида пропидия с изотермической амплификации, опосредованной петлей. Appl Environ Microbiol. 2011.пмид:21498750
  36. 36. Li J, Liu Q, Wan Y, Wu X, Yang Y, Zhao R и др. Быстрое обнаружение следа Salmonella в молоке и цыплятах с помощью иммуномагнитного разделения в сочетании с иммунохимическим анализом микрочастиц хемилюминесценции. Анальный биоанальный хим. 2019. пмид:31273413
  37. 37. Лаубе Т., Кортес П., Льягостера М., Алегрет С., Пивидори М.И. Иммунофагомагнитный анализ для экспресс-обнаружения Salmonella .

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.